乙酰辅酶A羧化酶2通过调控细胞周期促进肝癌细胞增殖

目的 研究乙酰辅酶A羧化酶2（acetyl-co carboxylase 2,ACC2）对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响以及其潜在的作用机制。方法 通过TCGA、GEO、CPTAC数据库对ACC2在肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者肝脏组织中的表达和预后价值进行分析。采用CRISPR-Cas9系统构建了ACC2敲低肝癌细胞系,观察肝癌细胞增殖、迁移能力以及细胞周期的变化,Western blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达。结果 ACC2在肝癌组织中低表达（P<0.05）且与预后不良相关（P<0.05）。体外细胞功能学实验表明降低ACC2表达显著促进肝癌细胞增殖、迁移能力（P<0.05）。细胞周期流式分析显示敲低ACC2促进肝癌细胞周期G1/S期的转变（P<0.05）,细胞周期相关蛋白中CyclinE2和p21的表达降低,而CyclinA2和p-RB的表达升高。结论 ACC2可以促进肝癌细胞增殖和迁移的能力,对细胞增殖的促进作用是通过加速肝癌细胞周期G1向S期的转化实现的。     

重复加热对肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期蛋白D1的影响

目的探讨多次热疗后残存下来的HepG2细胞增殖速度的变化及与此相关的可能原因。方法HepG2细胞43℃加热，每次80分钟，每天两次，共10个循环后，分析细胞倍增时间，检测细胞周期及细胞周期素D1的表达。结果热处理后的HepG2细胞增殖加快，细胞周期中S期和G2期的比率增高，细胞周期素D1的表达增强。结论热处理后的HepG2细胞增殖加快与其完成DNA复制而进入分裂的细胞比率高、细胞周期素D1的表达增强有关。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。     

细胞周期蛋白D1与胃癌

细胞增殖周期失控是恶性肿瘤呈现无限制增殖的重要原因 ,研究显示细胞周期正调及负调因子表达紊乱与人类胃癌的发生、发展密切相关。调控细胞周期诸多因素的核心是细胞周期蛋白 (ｃｙｃｌｉｎ)与细胞周期蛋白激酶 (ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ ,ＣＤＫ) ,与肿瘤关系最密切者为ｃｙｃｌｉｎＤ。目前 ,ｃｙｃｌｉｎＤ基因已被认为是一种原癌基因 ,它与胃癌发生、发展关系的研究正在不断深入。1　ｃｙｃｌｉｎＤ的结构与表达ｃｙｃｌｉｎＤ有 3种即ｃｙｃｌｉｎＤ1、ｃｙｃｌｉｎＤ2和ｃｙｃｌｉｎＤ3,蛋白依次为 11ｑ13的ＣＣ…     

细胞周期调控与表皮细胞增殖

细胞周期是细胞生命活动的基本过程。细胞周期调控机制中，以细胞周期素、细胞周期素依赖性激酶以及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白为核心的细胞周期调控因子通过复杂有序的调控，保证细胞周期的正常运行。细胞周期素与细胞周期素依赖性激酶的结合是启动细胞周期，并使其顺利运行的关键；而细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白在细胞周期中发挥主要的负调控作用。这一机制在表皮细胞增殖调控中起重要作用。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白Dl及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段，克隆到pGEM-T easy载体上。测序鉴定后切下相应的片段，连接到表达载体pET-22b( )上，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3)，使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定表达蛋白。【结果】 用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌，Western blot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】 本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体，后两在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白．     

RhoA蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的: 探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制.方法: 构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布.结果: 野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系.与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞Rho A蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调, p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降.结论: 转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑.     

白花丹醌对瘦素刺激的人肝星状细胞周期及其相关蛋白表达的影响

目的 研究白花丹醌对瘦素刺激的体外培养人肝星状细胞（HSC-LX2）细胞周期及周期相关蛋白表达的影响,探讨白花丹醌抗肝纤维化的作用机制。方法 ELISA法检测HSC-LX2细胞培养上清液中自分泌瘦素水平。将HSC-LX2细胞分成对照组,瘦素组,白花丹醌2、8 μmol/L组,秋水仙碱6.25 μg/mL阳性对照组。除对照组外,其余各组细胞用瘦素100 μg/mL刺激24 h、再与药物共同培养24 h后,流式细胞仪检测HSC-LX2细胞周期,Western blotting法检测细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E1、p21的表达。结果 HSC-LX2细胞自分泌瘦素的浓度先随着培养时间的延长而递减,24 h达到低谷值,48 h后又升至6 h水平,每个时间点分泌的瘦素量无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比,瘦素组HSC-LX2细胞增殖能力显著增强,S期和G₂/M期细胞比例显著增加;而白花丹醌2、8 μmol/L干预后,HSC-LX2细胞G₀/G₁期细胞的比例明显提高,而S期和G₂/M期细胞比例明显降低,且呈明显的浓度相关性。与对照组比较,瘦素组HSC-LX2细胞经瘦素刺激后细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E1的量显著增加,p21蛋白的表达受到抑制;白花丹醌2、8 μmol/L和秋水仙碱明显降低cyclin Dl、cyclin E1蛋白水平,增强p21蛋白表达。结论 白花丹醌可明显抑制瘦素诱导的HSC-LX2细胞增殖,该作用主要是通过抑制细胞由G₀/G₁期向S期转变而产生的,作用机制可能与其降低cyclin Dl、cyclin E1蛋白水平,增加p21蛋白表达相关。     

宫颈鳞状细胞癌及宫颈上皮内瘤样变组织中HPV16感染与P21waf、Ki67表达的关系及意义

目的：探讨人类乳头瘤病毒（HPV）感染与P21^waf、Ki67表达在人类宫颈鳞癌及其癌前病变中的关系。方法：利用组织芯片技术结合原位杂技术和免疫组化方法，研究了130例正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤样变组织和宫颈鳞癌组织中旧V感染以及Ki67、P21^waf表达的情况。结果：①在8／22CINⅠ，7／11CINⅡ，11／13CINⅢ，4／6原位癌，41／52宫颈鳞癌中为HPV16杂交信号阳性，CINⅢ、浸润癌与正常宫颈组织相比，HPV16杂交信号阳性率差异有显著统计学意义（P〈0．05）；②P21^wag在癌组织中的阳性率及强度都低于正常宫颈组织（P〈0．05），且P21^waf的表达与旧V16感染之间为负相关）（P〈0．05，r=-0．337）；③CINⅡ和宫颈浸润性鳞癌与正常宫颈组织相比，Ki67的表达有显著差异，统计学意义（P〈0．05），但Ki67表达与HPV16的感染不具相关性（P〉0．05）；④P21^waf与Ki67的阳性表达在CIN演变到宫颈鳞癌的过程中呈现负相关性（P〈0．05。r=-0．406）。结论：宫颈鳞癌的形成与HPV16的感染、P21^waf的弱表达或阴性表达以及Ki67的高表达有很大关系。HPV16与P21表达为负相关，P21表达与Ki67表达也为负相关。进一步揭示了HPV16引起宫颈癌的作用机制，并且可配合细胞学检查，对宫颈鳞癌的早期诊断具有一定临床价值。     

氯化锂对肝癌细胞BEL-7402增殖、周期的影响及其作用机制

目的探讨氯化锂对人肝癌细胞BEL-7402增殖、周期的影响及其作用机制。方法应用MTT法及DNAPREP细胞周期法检测BEL-7402经氯化锂作用后的增殖及周期改变情况,Westernblot检测糖原合成激酶-3（GSK-3）、失活pGSK-3及其下游分子CyclinDl的表达情况。结果氯化锂可显著抑制BEL-7402的增殖,并呈时间、剂量依赖性（P〈005）;氯化锂可使BEL-7402的G0/G1期比例明显降低、GJM期比例显著升高（P〈0．05）;氯化锂作用后GSK-3、失活pGSK-3及CyclinDl蛋白的表达水平均明显升高（P〈0．05）。结论氯化锂可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能是通过抑制GSK一3活性并上调CyclinDl表达使肝癌细胞阻滞于G2/M期。     

曲古霉素A对人肾细胞癌Caki-1细胞体外生长的影响

目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)体外对人肾细胞癌Caki-1细胞生长情况、乙酰化组蛋白H3的水平以及基因P21cip1/waf1 mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测TSA对Caki-1细胞生长的影响;蛋白质印迹法检测TS...     

HPV16感染与端粒酶hTERT、P21waf、Ki67表达在宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变组织中的关系及意义

目的：探讨HPV16感染与端粒酶hTERT、Ki67、P21^waf表达在人类宫颈鳞癌及其癌前病变中的关系及其意义.方法：利用组织芯片技术结合原位杂交技术和免疫组织化学方法研究130例正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤样变组织和宫颈鳞癌组织中HPV16感染以及端粒酶hTERT、Ki67、P21^waf表达的情况.结果：①在8/22 CIN Ⅰ、7/11CINⅡ、11/13 CINⅢ、4/6原位癌,41/52宫颈鳞癌中为HPV16杂交信号阳性,CINⅢ、浸润性鳞癌与正常宫颈组织相比HPV 16杂交信号阳性率差异有显著统计学意义（P均＜0.05）;②从CINⅡ、CINⅢ到浸润癌hTERT表达与正常组织相比,差异皆有显著统计学意义（P均＜0.05）,且细性程度逐渐增加.hTERT表达在各级癌及癌前病变组织中与HPV16型的感染率之间也呈现出正相关性（P＜0.05,r=0.339）;③P21^waf在癌组织中的阳性率及强度都低于正常宫颈组织（P＜0.05）,且P21^waf的表达与HPV16感染、hTERT表达之间具有负相关性（P＜0.05,r=-0.337;P＜0.05,r=-0.248）;④与正常宫颈组织相比从CINⅡ到宫颈浸润性鳞癌Ki67的表达,其差异有显著统计学意义（P＜0.05）,但Ki67的表达与HPV16的感染不具有相关性（P＞0.05）,与hTERT表达之间具有相关性（P＜0.05,r=0.398）,与P21^waf呈现出负的相关性（P＜0.05,r=-0.446）.结论：HPV16感染与hTERT、P21^waf、Ki67互相作用,共同影响宫颈鳞癌的发生发展.这些指标利于阐明HPV16的恶性转化机制以及为提高宫颈鳞癌及其癌前病变诊断率提供依据.     

p21^waf1在贲门癌中的表达及其与生存的关系

目的研究p21^waf1在贲门癌中的表达状况,分析其表达与临床病理特征及生存之间的关系,进一步探讨贲门癌的发病机制。方法应用免疫组化及组织芯片技术,对78例贲门癌组织中的p21^waf1蛋白表达情况进行分析。结果贲门癌中p21^waf1蛋白的阳性表达率为65．4％,其表达与肿瘤分化程度、浸润深度和Lauren分型有关（均P〈0．05）。Kaplan-Meier生存分析表明,p21^waf1表达与贲门癌患者的预后相关（P〈0．05）。结论同正常对照组相比,贲门癌中p21^waf1蛋白的表达水平升高,其表达与贲门癌的生物学行为密切相关,阳性表达患者预后优于阴性者,但尚不能作为一个独立的预后指标。     

地塞米松对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察不同浓度的地塞米松(Dex) 对人乳腺癌细胞系(MCF-7) 细胞增殖、细胞周期分布及P21/WAF1表达的影响.方法:以不同浓度Dex(10-10～10-6 mol/L)处理细胞,采用活细胞计数法观察细胞增殖情况;测定碱性磷酸酶(AKP)活性;通过流式细胞仪技术,测定Dex作用后其细胞周期分布;通过蛋白印迹分析的方法检测Dex对p21/WAF1表达的影响.结果:Dex对MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用, 10-7mol/L Dex作用5 d后活细胞计数为对照组的70%,细胞在G0/G1期停滞; Dex还可使MCF-7 细胞AKP活性增高,这种作用具有时间和剂量依赖性;Dex对p21/WAF1表达无明显影响.结论:Dex对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用,细胞在G0/G1期停滞.     

Galectin-1、P21、P27在子宫颈鳞状细胞癌和癌前病变中的表达及意义

目的分析Galectin-1、P21、P27在子宫颈癌前病变和子宫颈鳞状细胞癌（Cervical squamous cellcarcinoma,CSCC）中的表达,探讨其在宫颈癌变过程中的作用机制。方法采用免疫组织化学S-P法,检测20例正常宫颈组织、39例子宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅰ、40例CINⅡ、40例CINⅢ和54例CSCC组织中Galectin-1、P21、P27蛋白的表达。结果 Galectin-1和P21在CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ和CSCC组织中阳性表达率明显高于正常宫颈组织,差异有统计学意义（P〈0.05）。P27在CINⅢ和CSCC组织中阳性表达率明显低于正常宫颈组织,差异有统计学意义（P〈0.05）。但Galectin-1、P21、P27在CIN组间及CSCC组间差异无统计学意义（P〉0.05）。Galectin-1阳性表达的41例CSCC中P21阳性表达38例,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。Galectin-1阳性表达的41例CSCC中P27阳性表达13例,两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 Galectin-1和P21高表达、P27低表达与宫颈癌的发病密切相关,可为宫颈癌前病变发展为浸润性鳞癌提供动态观察的参考指标。     

TSA对食管癌细胞系EC9706细胞周期作用及分子机制的探讨

目的 研究去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)对食管癌细胞 EC9706细胞周期的作用及机制.方法 将浓度为0.5、1.0、1.5 μmol/L TSA作用EC9706细胞24 h,用MTT观察不同浓度 TSA 对 EC9706细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测细胞生长及周期;Western Blot检测TSA对食管癌细胞周期相关基因的表达.结果 1.0 μmol/L 浓度的TSA 对EC9706 细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系,在1.0 μmol/L浓度之上可明显诱导食管癌细胞EC9706细胞周期阻滞,明显增强p21、p27基因的表达,明显降低 CCND1、CDK4D基因的表达.结论 一定剂量的TSA可抑制食管癌EC9706细胞的生长,通过调控多个细胞周期相关基因诱导食管癌细胞细胞周期阻滞,细胞阻滞的发生与p21、p27基因表达的增加及CCND1、CDK4D基因表达的减少相关.     

负向调控p21对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

探讨AU 结合因子1（AUF1）调控p21对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 采用qRT-PCR和Western blot分别检测AUF1在骨肉瘤组织mRNA和蛋白表达水平。在骨肉瘤U2OS和HOS细胞中分别转染sh-NC和sh-AUF1后,CCK8检测细胞增殖情况;qRT-PCR检测增殖相关分子PCNA的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关分子Cleaved-caspase-3的表达水平。RNA结合蛋白免疫沉淀实验和RNA半衰期实验检测AUF1调控p21的机制。结果 AUF1 mRNA和蛋白的表达水平在骨肉瘤组织中明显高于癌旁正常组织（P＜0.05）,AUF1 mRNA的表达水平在骨肉瘤伴转移的患者中明显高于骨肉瘤不伴转移的患者（P＜0.05）。在U2OS和HOS细胞中分别转染sh-NC和sh-AUF1,AUF1 mRNA和蛋白的表达水平在转染sh-AUF1组较sh-NC组明显下降（P＜0.05）。低表达AUF1能够明显抑制U2OS和HOS细胞的增殖和增殖相关分子PCNA的表达（P＜0.05）,促进细胞凋亡和凋亡相关分子Cleaved-caspase-3的表达（P＜0.05）。低表达AUF1能够明显促进U2OS和HOS细胞中p21 mRNA和蛋白的表达水平（P＜0.05）。AUF1蛋白能够与p21 mRNA结合,同时低表达AUF1能够明显抑制p21 mRNA的降解速度（P＜0.05）。结论 AUF1在骨肉瘤组织和细胞中明显高表达,低表达AUF1能够抑制p21 mRNA 降解,增加p21蛋白的表达,进而抑制骨肉瘤细胞增殖和促进细胞凋亡     

CCK对胆管癌细胞增殖及P21WAF1、P27KIP1基因表达的影响

目的：探讨胆囊收缩素（Cholecystokinin,CCK)促进胆管癌细胞增殖的可能机制。方法：采用细胞增殖计数法及流式细胞仪分析CCK对胆管癌细胞生长，增殖及细胞周期的影响，RT－PCR，Western印这法检测CCK对P21^WAF1,P27^KIP1基因表达的影响。结果：CCK具有显著促进无血清培养的胆管癌细胞的生长和增殖，加速细胞周期的进程，P21^WAF1,P27^KIP` mRNA和蛋白水平表达明显降低。结论：CCK促进胆管癌细胞增殖可能与下调细胞周期相关蛋白P21^WAF1,P27^KIP1的表达有关。