NDY1shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达

目的：构建NDY1 shRNA真核表达载体,并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据Gen‐Bank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列,设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA（shRNA）序列,插入表达载体获得重组质粒pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后,脂质体介导转染A2780细胞,经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞,采用实时定量聚合酶链反应法（RT‐qPCR）和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确,转染shNDY1后,A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降（72．89±4．83）％及（55．85±4．84）％,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论成功构建 pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1真核表达质粒,并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞,为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。     

PDLIM5 shRNA质粒构建及其稳定转染SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建PDLIM5 shRNA真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y(成神经细胞瘤细胞)细胞系。方法合成PDLIM5基因干扰序列并插到RNAi真核表达载体p GFP-V-RS质粒中,通过酶切和测序进行鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒PDLIM5 shRNA和对照质粒PDLIM5 Scramble经脂质体Lipofectamine 2000介导转染SH-SY5Y细胞,经puromycin持续筛选和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。RT-PCR及Western blot分别检测PDLIM5 mRNA及蛋白表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组获得的干扰真核表达质粒PDLIM5 shRNA与预期完全相同。PDLIM5 shRNA稳定转染SH-SY5Y细胞在荧光显微镜下呈亮绿色。RT-PCR及Western blot检测显示PDLIM5 mRNA及蛋白表达明显下调。结论成功构建PDLIM5 shRNA真核表达载体及其稳定转染SH-SY5Y细胞系,为进一步研究PDLIM5在精神疾病中的功能奠定实验基础。     

Livin shRNA表达载体的构建及其稳定转染宫颈癌siha细胞系的建立

目的 构建Livin shRNA真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的宫颈癌siha细胞系.方法 合成Livin基因干扰序列并定向插入到RNA干扰(RNAi)真核表达载体pGenesil-1质粒,通过测序进行鉴定.干扰质粒经脂质体Lipofectamine 2000介导转染siha细胞.经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.RT-PCR检测所筛选克隆Livin mRNA的转录水平.结果 测序证明Livin干扰序列及读码框完全止确,干扰质粒稳定转染的siha细胞在倒置荧光显微镜下呈明亮绿色荧光.RT-PCR结果显示Livin shRNA序列对Livin mRNA有较好的抑制效果.结论 成功构建了Livin shRNA真核表达载体,Livin shRNA质粒稳定转染的siha细胞系的建芷为进一步研究Livin在官颈癌细胞中的作用奠定了基础.     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

针对人β-catenin基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建针对人β-catenin基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染HEK-293细胞,观察其对β-catenin的抑制效应。方法:化学合成用于产生针对β-catenin shRNA的对应DNA片段,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,克隆入pSUPER真核表达载体,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定,筛选阳性克隆。通过脂质体介导,把重组质粒转染HEK-293细胞,RT-PCR、蛋白质印迹法检测其对β-catenin mRNA和蛋白的干涉效果,MTT比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示转染组β-catenin基因的表达水平下调,MTT检测显示β-catenin表达抑制的细胞光密度值下降,细胞增殖受到了抑制（P<0.01）。结论:成功构建了针对人β-catenin基因的shRNA载体,转染HEK-293细胞后可抑制β-catenin基因的表达。     

靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建

目的构建针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。     

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的 采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系.方法 合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2.脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达.结果 测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P＜0.01,差异有统计学意义. 结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础.     

人HMGB1真核表达载体的构建及其在单核细胞的表达

目的构建人高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达载体,并探讨其免疫调节作用。方法从HMGB1克隆载体酶切分离HMGB1基因片段,插入增强型绿色荧光蛋白载体pCITE EGFP,菌落PCR和酶谱分析鉴定重组载体。重组表达质粒转染人单核细胞系（U937）,梯度G418筛选,荧光和Western blot检测HMGB1的表达。结果菌落PCR和酶谱分析显示目的基因被正确插入真核表达载体,获得重组质粒pCITE EGFP HMGB1,转染U937细胞随培养基中G418浓度的升高而增强,转染细胞中目的蛋白HMGB1表达量明显升高。结论成功构建重组载体pCITE EGFP HMGB1,并获得稳定表达人HMGB1的单核细胞系,为研究HMGB1对单核巨噬细胞的作用及其机制奠定基础。     

MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

稳定表达丙肝病毒EGFP-CORE融合蛋白细胞系的建立

目的：构建可表达丙型肝炎病毒（HCV）EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法：克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中，脂质体法转染QSG7701细胞后，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果：成功构建真核表达载体pEGFP-C1／CORE；建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论：重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE，为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。     

乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选

目的：构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶（Hpa）特异性基因真核表达载体．方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa shRNA双链,将两两随机问隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluoreseent protein,EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa—shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达．结果：酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE—shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别．结论：构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA．     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

CD40发夹siRNA真核表达质粒与siRNA表达框架对CA46细胞CD40表达的影响

目的 构建人类CD40膜蛋白siRNA真核表达质粒，观察其能否抑制CA46细胞CD40表达。方法 合成2条编码发夹siRNA序列的单链DNA，克隆到pSilenCircle载体中，构建成含目的基因片段的重组质粒——siCD40／pSilenCircle，在polⅢ U6基因启动子控制下表达siRNA。同样方法构建相对应的编码反义RNA以及无关基因的重组质粒anticD40／psilencircle和siFly／psilen Circle，以作比较和对照。PCR制备CD40-SECs（CD40-siRNA表达框架）。以脂质体FuGene6为介质瞬时转染CA46细胞，利用流式细胞技术检测细胞膜CD40的表达。结果 （1）成功构建了CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSilen Circle、CD40反义RNA真核表达质粒anticD40／psilencircle和无关基因重组质粒siFly／psilencircle；（2）PCR成功制备CD40-SEC；（3）与siFly／pSilencircle转染组相比较，siCD40／pSilenCircle、anticD40／pSilencircle和CD40-SEC转染组的CA46细胞CD40的表达均明显减少。结论 CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSnencircle和CD40-SEC可有效地抑制CA46细胞CD40分子的表达。RNA干扰技术可望作为一种有效的调控基因功能的工具。     

针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染

目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响.方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体.应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态.结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象.结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞.     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的 构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法 过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVXshRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低（P均<0.05）。结论 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。     

靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经...     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。