Gravin参与血管内皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞体外血管形成

目的研究Gravin在血管内皮生长因子（VEGF）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移和体外“小管样结构”（TLS）形成中的作用。方法用VEGF诱导HUVEC,通过Western blot和细胞免疫荧光分析Gravin在细胞内分布的变化;用Gǒ6983【蛋白激酶C（PKC）抑制剂】和VEGF共处理内皮细胞,观察对Gravin分布的影响,观察其对VEGF诱导HUVECs迁移和TLS形成的影响。结果VEGF呈时间和剂量依赖性诱导Gravin磷酸化,并向核周和细胞边缘重分布;以上效应能被0.5μmol/LGǒ6983抑制;Gǒ6983同时抑制VEGF诱导HUVEC迁移和TLS形成。结论PKC-Gravin信号通路参与VEGF诱导的内皮细胞迁移和血管形成。     

芍药苷对血管内皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞小管形成的影响

目的 利用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)研究芍药苷(PF)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的HUVECs小管形成的影响.方法 将HUVECs细胞株复苏培养,采用噻唑兰(MTT)法测定不同浓度PF(1、3、10、30、100μmol/L)对HUVECs细胞活力及对VEGF引起的细胞活力上升的影响,采用体外小管形成实验...     

血管内皮生长因子A调控人脐静脉内皮细胞miRNA的全基因表达谱分析

目的 ·分析人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中微小RNA(microRNA,miRNA)在血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)刺激下的变化,探索miRNA在调节VEGFA下游基...     

益心定悸方含药血清对人脐静脉内皮细胞VEGF表达影响的研究

[目的] 通过观察益心定悸方对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响探讨其治疗冠心病快速心律失常的作用机制, 同时为临床应用提供客观依据。[方法] 用20只雄性Wistar大鼠制备含药血清, 将内皮细胞接种在两种血清培养基上, 采用免疫组化方法测定VEGF的表达。[结果] 含药血清组细胞边界和核结构清晰细胞核颜色深染, 正常血清组VEGF仅有微弱表达。[结论] 益心定悸方能够明显促进VEGF表达, 这可能是本方治疗冠心病快速心律失常的作用机制之一。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性。将真核表达质粒pCD－hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线。结果发现：VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖。提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因。     

辛伐他汀对家兔主动脉粥样硬化斑块血管内皮生长因子表达的影响

目的:观察辛伐他汀对动脉粥样硬化斑块血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:雄性纯种新西兰大白兔,采用高脂肪、高胆固醇饲料喂饲构建主动脉粥样硬化(AS)模型,并随机分为辛伐他汀组(n=10)和单纯高脂饮食组(n=6);另有一组动物喂饲普通饲料作为空白对照组(n=8).采用免疫组织化学方法,观察3组动物AS斑块VEGF的表达情况.结果:辛伐他汀组和单纯高脂饮食组AS斑块VEGF阳性信号强度均显著高于空白对照组(P＜0.05);辛伐他汀组VEGF阳性信号强度又显著低于单纯高脂饮食组(P＜0.05).结论:提示辛伐他汀可一定程度稳定斑块,延缓AS的进程.     

Baicalein对人脐静脉血管内皮细胞12-脂氧化酶、血管内皮生长因子表达的影响

目的:观察baicalein作用于人脐静脉血管内皮细胞系ECV-304细胞后12-脂氧化酶(12-LOX)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的情况。方法:Baicalein处理培养的第2代血管内皮细胞,实验组分别用1,10,100μmol/L baicalein处理48h和30μmol/L的baicalein处理1,2,4,6d。设立空白对照组。RT-PCR检测各组12-LOX、VEGF的mRNA表达;Western blot免疫印记法检测各组12-LOX的表达水平。结果:RT-PCR扩增得到单一的产物,与预期的扩增序列大小完全一致,并且Western blot免疫印记法检测得出12-LOX的表达与baicalein的作用时间和作用浓度成反比。结论:血管内皮细胞自身能产生12-LOX、VEGF,它们均是促进新生血管的形成的因素,而baicalein抑制了12-LOX、VGEF的表达,从某一途径抑制新生血管的形成。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性.将真核表达质粒pCD-hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线.结果发现VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖.提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因.     

血管紧张素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响。方法体外培养HUVECs,取对数生长期HUVECs细胞接种96孔培养板中,常规培养细胞24 h后,弃掉旧培养基,加入新Ham′s F12k培养基,并分别加入AngⅡ,使其终浓度分别为0μmol.L-1、0.01μmol.L-1、0.1μmol.L-1、1μmol.L-1和10μmol.L-1,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测不同浓度AngⅡ在不同时间点的细胞活性,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果MTT结果:与对照组相比,1μmol.L-1AngⅡ组作用24 h和10μmol.L-1AngⅡ组作用12 h、18 h和24 h的HUVECs的细胞活性均显著下降(P<0.05或P<0.01),并呈现时间依赖性;其余各组差异均无统计学意义(P>0.05)。琼脂糖凝胶电泳结果:10μmol.L-1AngⅡ组作用18 h的HUVECs呈现明显的"梯状"DNA断裂条带。流式细胞术结果:对照组和10μmol.L-1AngⅡ组作用18 h的HUVECs细胞凋亡率分别为(1.11±0.54)%和(19.87±3.18)%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论10μmol.L-1AngⅡ可通过诱导细胞凋亡引起HUVECs损伤,从而可能在动脉粥样硬化发生发展中发挥作用。     

hVEGF121基因转染对人脐静脉内皮细胞生长的作用

目的:构建人血管内皮生长因子(hVEGF)-121的真核细胞复制表达质粒,将hVEGF121基因转染进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),通过旁分泌作用来加快其生长速度.方法:采用RT-PCR方法,从人胚胎成纤维细胞中克隆hVEGF121前体蛋白全长cDNA,构建重组真核表达质粒pcDNA3-hVEGF121,用FuGENE 6介导转染入HUVEC.收集转染的HUVEC培养上清,用ELISA法定量检测hVEGF蛋白的表达情况;绘制细胞生长曲线,检测hVEGF121促进HUVEC增殖的生物学活性.设转染pcDNA3空质粒载体和不转染任何DNA的HUVEC做对照.结果:(1)成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒,经测序证明基因序列与GenBank中核酸序列一致,且插入方向正确;(2)转染细胞瞬时表达hVEGF蛋白,于转染1d后每104个细胞每天可分泌hVEGF蛋白59.95 Pg,约为对照组的100倍;之后表达水平先快后慢下降,于转染7d后仍较对照组高近1倍;(3)转染细胞生长速度明显加快,在转染3 d后细胞数与对照组相比即有显著性差异(P＜0.01),细胞倍增时间从对照组的7d以上缩短为3d左右.结论:成功构建了pcDNA3-hVEGF121真核表达质粒;该质粒能在HUVEC中表达有生物活性的hVEGF121蛋白,通过旁分泌作用明显促进HUVEC的分裂增殖.     

人参三七组方对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子分泌及其受体2表达的影响

目的：探讨益气活血中药人参三七组方对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体2（vascular endothelialgrowth factor receptor-2,VEGFR-2）表达的影响。方法：体外培养HUVEC,分为高剂量人参三七组方（0.4 mg/mL）组、中剂量人参三七组方（0.2 mg/mL）组、低剂量人参三七组方（0.1 mg/mL）组,另设碱性成纤维细胞生长因子（bovine basic fibroblast growth factor,bFGF,320 U/mL）阳性对照组和只加培养液的空白对照组。酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中的VEGF含量,免疫细胞化学法检测VEGFR-2阳性细胞数及其光密度值,蛋白印迹法检测VEGFR-2蛋白的表达。结果：与空白对照组比较,高剂量人参三七组方组和bFGF组细胞上清液中VEGF含量增加（P〈0.05）,VEGFR-2阳性细胞数及光密度值增加,细胞中VEGFR-2蛋白表达增强。结论：促进HUVEC分泌VEGF和表达VEGFR-2可能是人参三七组方促血管生成的基础。     

他汀类药物对培养的血管内皮细胞VEGF和bFGF等因子表达的影响

目的观察Pitavastatin对血管内皮细胞VEGF、bFGF等因子表达的影响,探讨他汀类药物可能具有的独立于血脂调节作用以外的促血管新生作用.方法体外培养HUVEC,加入不同浓度的Pitavastatin后用蛋白印迹杂交法检测VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白表达水平;镉还原Griess测定培养基中NO含量.结果在培养的HUVEC中加入Pitavastatin后,VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白呈现高表达,培养基中NO含量明显增高.结论 Pitavastatin能诱导内皮细胞VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白的表达及增加NO含量,推测其可能通过VEGF-p-Akt-eNOS(NO)径路而发挥非调脂的作用.     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

Effects of simvastatin on cigarette smoke extract induced tissue-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 expression in human umbilical vein endothelial cells

Background Cigarette smoking has an influence on both arterial-type and venous-type thrombosis. However, little is known about the direct effect of cigarette smoke extract （CSE） on fibrinolytic activity of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Most recently, simvastatin has been marked in its effect on endothelial cells protection and anticoagulation. In this study, the effect of CSE on the expression of tissue-type plasminogen activator （t-PA） and plasminogen activator inhibitor-l（PAl-1） in HUVECs was addressed. The role of simvastatin in CSE-induced fibrinolytic activity changes was investigated as well. Methods The fourth to fifth generation of HUVECs were incubated respectively with 0, 5%, 10% and 20% CSE for 6 hours or exposed to 5% CSE for 0, 4, 6, 8, 12, 24 hours to determine the expression changes of t-PA and PAl-1 protein. Meanwhile, cells were also accordingly exposed either to 5% CSE alone or simvastatin pre-treated and 5% CSE for 24 hours to assess the role of simvastatin in CSE-induced t-PA and PAl-1 protein and mRNA expression in HUVECs. RT-PCR and ELISA techniques were used for detecting the t-PA or PAl-1 mRNA and protein. Results After 6-hour exposure to CSE, the expression levels of t-PA protein in 10% and 20% CSE-treated groups reduced significantly （（0.0365±0.0083） ng/ml, （0.0255±0.0087） ng/ml） when compared with that of control group （（0.0660±0.0120） ng/ml） （P 〈0.05）. In contrast, the levels of PAl-1 protein in 5%, 10% and 20% CSE-treated groups increased remarkably （（13.3225±0.5680） ng/ml, （14.2675±1.5380） ng/ml, （14.4292±1.6230） ng/ml） when compared with that of control group （（8.5193_±0.7537）ng/ml） （P〈0.05）. After stimulation with 5% CSE for 0, 4, 6, 8, 12, 24 hours, the levels of PAl-1 protein increased over time and reached the peak at 24 hours （（14.6400±1.0651） ng/ml）, which was significantly higher than that of control group （（12.0656±0.6148） ng/ml） （P 〈0.05）. Additionally, CSE could up-regulate PAl-1 expression at both the mRNA and the protein levels. The levels of PAl-1 mRNA and protein increased significantly in 5% CSE-treated group （（8.8030±0.4745） ng/ml, （1.8155±0.0412） ng/ml） compared with those of control groups （（5.0588±0.2315） ng/ml, （1.3030±0.0647） ng/ml） （P 〈0.01）, and decreased after 2-hour simvastatin pre-treatment （（5.4875±0.3166） ng/ml, （1.3975-±0.0297） ng/ml） （P 〈0.01）. No significant difference was found at the levels of t-PA protein and mRNA （P 〉0.05）. Conclusions CSE inhibits the fibrinolytic activity of HUVECs in vitro. Simvastatin plays a protective role in CSE-induced fibrinolytic malfunction.     

益母草对人脐静脉内皮细胞组织因子转录及表达的影响

目的 探讨益母草(Leonurus Heterophyllus Sweet,LHS)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)组织因子(TF)表达和转录的影响.方法 HUVECs的培养按Jaffe法,选用第2代细胞进行试验.测定不同浓度LHS处理前后组织因子表达,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TF mRNA水平.结果 LHS对HUVECs TF活性及TFmRNA转录的影响与正常对照组相比差异有明显统计学意义(P＜0.01).结论 LHS能下凋HUVECs TF的表达,干预HUVECsTFmRNA的转录.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 观察丙氨酰谷氨酰胺二肽（丙谷二肽）对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法 在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝（MTT）比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）活性,比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6 (IL-6)、热休克蛋白70 (HSP70)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 和缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) mRNA的表达。结果 丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1α mRNA的表达增加。结论 丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。     

盐酸苄丝肼对脂多糖所致人脐静脉内皮细胞炎症的影响及其机制研究

通过脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立体外炎症模型,进一步验证盐酸苄丝肼的抗炎作用,并探究盐酸苄丝肼抗炎抗动脉粥样硬化的相关分子机制。实验分为空白组(PBS+0.5% FBS DMEM培养基)、模型组［LPS(500 μg/mL)+0.5% FBS DMEM培养基］及给药组［LPS(500 μg/mL)+盐酸苄丝肼+0.5% FBS DMEM培养基］,采用Western blot、ELISA和qPCR检测HUVECs细胞中炎症因子血清淀粉样蛋白P(SAP)、TNF-α、MCP-1蛋白和mRNA的表达水平。采用Western blot检测p65/p-p65、p38/p-p38、IκBα/p-IκBα和AKT/p-AKT的表达水平及p65、p38、IκBα的入核情况。结果显示,盐酸苄丝肼(1×10^-9、1×10^-10、1×10^-11 mol/L)能显著抑制促炎细胞因子SAP、TNF-α和MCP-1的蛋白及其mRNA的表达,在下调p65/p-p65、p38/p-p38、IκBα/p-IκBα和AKT/p-AKT的蛋白表达的同时抑制p65、p38、IκBα的核转位,从而抑制相关基因的转录活性。