小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达和免疫学活性鉴定

研究小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）H 蛋白生物学活性,为建立PPRV 抗体检测方法提供材料。根据 GenBank 已发表的 PPRV H 蛋白质序列,设计上、下游引物,以 PPRV核酸为模板进行 PCR 扩增,扩增产物克隆至 pET52／LIC 载体中,构建了 pET52／LIC-PPRV H 表达载体。将 pET52／LIC-PPRV H 重组质粒转化大肠埃希菌 BL21（DE3）进行融合表达,经 SDS-PAGE 电泳分析,可见 PPRV H 蛋白成功得到了表达,融合蛋白的分子质量约为75 ku,Western blot 分析表明所表达的重组蛋白可与 PPRV 阳性血清发生特异性反应,说明表达的 PPRV H 蛋白可以作为建立 PPRV 抗体检测的蛋白。     

经密码子优化的小反刍兽疫病毒H蛋白在昆虫细胞中的表达

小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员。本实验室已经证明,该病毒的囊膜糖蛋白H蛋白在未经密码子优化条件下难以在昆虫细胞中表达。本研究首先对其密码子进行优化,然后构建了在昆虫细胞中表达该蛋白的重组杆状病毒。经Western-blot和间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒在昆虫细胞中能够表达H蛋白,但表达量相对较低。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

一步法RT-PCR检测小反刍兽疫病毒

为建立一步RT-PCR检测小反刍兽疫病毒(PPRV)方法,针对Gen Bank中PPRV F基因进行序列比较分析,设计一对特异性引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了一步RT-PCR检测PPRV方法。该方法最佳退火温度为60℃,最佳引物用量为8pmo L/μL。利用这种方法对小反刍兽疫临床阳性样本进行检测,获得了特异性的扩增目标条带,但不与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、犬瘟热病毒等发生反应。本方法具有高度灵敏性,最低检测量为3.576×10-5g/L,可广泛应用于临床小反刍兽疫病毒核酸的检测。     

经密码子优化的小反刍兽疫病毒H蛋白在昆虫细胞中的表达

小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员。本实验室已经证明,该病毒的囊膜糖蛋白H蛋白在未经密码子优化条件下难以在昆虫细胞中表达。本研究首先对其密码子进行优化,然后构建了在昆虫细胞中表达该蛋白的重组杆状病毒。经Western-blot和间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒在昆虫细胞中能够表达H蛋白,但表达量相对较低。     

小反刍兽疫病毒反向遗传学研究进展

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的山羊、绵羊等小反刍动物的急性、高度接触性传染病。反向遗传学是在获得生物基因信息的基础上,对基因进行突变、缺失等操作,进而研究基因变化对表型的影响。本文综述了包括PPRV在内的单股负链RNA病毒反向遗传学的最新研究进展,以期为PPRV及同科属病毒的反向遗传操作系统的建立提供新的思路。     

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。     

小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备及间接ELISA检测方法的建立

将编码小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的基因全长克隆到pBacPAK9载体中,并在昆虫细胞中进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用PPRV阳性血清进行了Western blot鉴定。用Ni-IDA亲和柱对组氨酸融合表达的N蛋白进行了纯化,并对纯化产物进行了理化性质和抗原活性分析。最后以表达的N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,临床检测137份山羊血清并与IDvet公司的商品化PPRV抗体检测试剂盒进行比较。结果表明,制备的PPRV N蛋白抗原在溶液中以单体形式存在,具有非常好的抗原活性。用该蛋白建立的间接ELISA检测方法与IDvet试剂盒符合率为956%。本研究为小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备相关质量标准的建立奠定了基础,同时建立的ELISA抗体检测方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒F蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。     

施马伦贝格病毒

施马伦贝格病毒病(Schmallenberg virus,SBV)是一种新发现的动物传染病,因于2011年底在德国施马伦贝格镇首次发现而临时得名,随后蔓延于西欧(包括比利时、法国、德国、荷兰、意大利、卢森堡、西班牙、英国和丹麦),并分别在奥地利、波兰、瑞典和芬兰等国的牛、山羊、绵羊中检测到抗体。遗传分析显示该病毒与布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)西姆布血清群病毒(Simbu serogroup viruses)的亲缘关系最密切,西姆布血清群病毒是已知的反刍动物病原,可通过节肢动物媒介(蚊、蠓)传播。施马伦贝格病毒病有2种不同的临床症状:成年牛出现短暂轻微/温和的病症(产奶量减少、发热、腹泻)和新生哺乳动物(牛、羊)死产和先天缺陷。因为同群类似的病毒不是人畜共患病病原,也无该病毒致人发病的证据,但现阶段尚不能完全排除。尽管目前没有特效的药物和疫苗,但因已有类似病毒(赤羽病)的疫苗,疫苗接种应是控制该病的可能选项。因施马伦贝格病毒是一种新发现的病毒,许多方面尚不清楚,还有待于进一步研究。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

尼帕病毒病

尼帕病毒病（Nipah virus disease,NV)是一个新近被认识的人畜共患病，该病于1999年3月首次被分离。人和家畜通过接触感染动物而被感染，依其在马来西亚最初被检测到的地名而将其命名为尼帕病毒病（NV），它和另一个新近认识的病毒－亨得拉病毒（Hendra ivrus，HIV)具有一定的同源关系。HIV于1994年在澳大利亚亨得拉镇首次发现并以此地而命名。NV和HV都属于副粘病毒科家族成员，虽然这些病毒仅仅能引起一些病例的爆发，但因它们具有感染突主范围广，感染人类能引起高死亡率等生物特性，已引起了公众对尼帕病毒的重视及对基对公司健康影响的关注。     

阻断猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒的传播

猪舍＂空气过滤技术＂对预防猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）不是100%有效,但比仅依赖于传统生物技术来阻止PRRS效果要好一些。     

Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用

Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。     

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡

本文建立了一种同时检测ＤＮＶ、ＩＢＶ、和ＭＧ４种病原体的多重ＰＣＲ技术。根据ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ的基因文库,设计了４对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ某段基因序列互补的引物,用这４对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧＲＶＡ和ＤＮＡ模板进行多重ＰＣＲ扩增,结果均同时得到了４条特异性大小与实验设计相符的３１０ｂｐ（ＮＤＶ）、１７２０ｂｐ（ＩＢＶ）、６４７ｂｐ（ＩＬＴＶ）和７３２ｂｐ（ＭＧ）多重ＰＣＲ扩增带,而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ技术难检出１０ｐｇ的ＩＢＶ、１ｂｇ的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和ＩＬＴＶ、１ｐｇ的ＭＧ ＤＮＡ模板。