利用梯度平板法结合紫外诱变、抗性筛选选育土霉素高产菌株

以龟裂链霉素TMSⅠ12-66为出发菌株,通过紫外-氯化锂诱变处理,并结合梯度平板法、氯化锂和四环素复合抗性平板上筛选土霉素高产菌株。通过对致死率的考察,确定了紫外的最佳诱变剂量为90 s。在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入四环素进行正突变株的定向筛选。经过选育得到一株土霉素的高产菌株TMSⅠ14-180,摇瓶发酵验证效价达22985 mg/mL,较出发菌株提高22.36%,经传代试验考察,该菌株遗传性状稳定。     

副猪嗜血杆菌链霉素耐药基因rpsL、rrs分析和关键位点的鉴定

为研究副猪嗜血杆菌(HPS)链霉素(SM)抗性的分子基础,本实验采用甲基磺酸乙酯(EMS)间断传代诱导HPS SC1401菌株,构建SM抗性突变株,测定其对SM的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并对其耐药基因rpsL和rrs进行测序;通过对比分析筛选出rpsL基因中两个引起SM完全耐药的突变位点;为了进一步验证突变位点与抗性的关联性,设计位点突变引物以构建突变型质粒,并分别转化到亲本株中,获得单一位点突变菌株,测定其对SM的MIC和MBC。结果显示:EMS诱导的SM抗性突变菌株rpsL基因第43号(AAA→AGA)或第88号密码子(AAA→AGA)发生了突变,rrs基因未检测到突变;该抗性突变菌株与单一位点突变菌株1401D43和1401D88对SM的MIC和MBC均大于8 192μg/mL,远高于亲本株SC1401的SM抗性水平。实验结果表明,HPS的SM抗性主要由rpsL基因特定位点突变引起,其中,rpsL基因第43号和第88号密码子为主要突变位点。本实验为完善HPS耐药分子机制研究,特别是对氨基糖苷类药物产生耐药的分子基础提供一定的参考。     

纤维素酶高产菌株的选育

从土样中分离筛选出12株产纤维素酶能力较强的菌株。经摇瓶发酵复筛,获得产纤维素酶活较高且稳定的菌株F6,其CMC酶活为887 U/mL,滤纸酶活为210.72 U/mL。以该菌株为出发菌株,经紫外线诱变处理,获得纤维素酶高产菌株4-2-2。将菌株4-2-2摇瓶发酵4 d后,产CMC酶活达3171.598 U/mL,滤纸酶活达1827.372 U/mL,分别比出发菌株提高3.58倍和8.67倍。     

常压室温等离子体结合紫外诱变筛选红霉素高产菌株

利用常压室温等离子体射流诱变(ARTP)和紫外照射对红霉素产生菌进行复合诱变,得到4株产量明显提高的突变菌株,4株菌的平均发酵效价较出发菌株提高25.2%;其中一株(12#菌株)经发酵摇瓶验证,红霉素发酵单位可达10029单位/mL,比出发菌株提高了28.6%,且遗传稳定性良好。实验证明ARTP-UV复合诱变是一种简单高效的筛选方法。     

复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株

以黑曲霉SD16为出发菌株,经紫外线和N 注入诱变处理,选育高产β-萄聚糖酶菌株.结果表明:紫外线的最佳照射时间为10min,N 最佳注入剂量为70×2.6×1012 N /cm2;突变高产菌株AN1的β-葡聚糖酶酶活由出发菌株SD16的493.2 U/mL提高到902.5 U/mL.且突变菌株AN1经传5代培养,产酶性能稳定.     

弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV工程菌的构建

为提高弗氏链霉菌对泰乐菌素的产素能力,构建了弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV基因工程菌。本研究以弗氏链霉菌作为出发菌株,并以其全基因组DNA为模板分别扩增tylF和tylE以及tylCV基因、以质粒pSET152为模板扩增强启动子基因permE,采用重叠延伸PCR技术和EcoRV、XbaI双酶切结合的连接方法,构建弗氏链霉菌表达载体pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV,并转化至大肠杆菌ET12567,利用大肠-链霉菌属间接合转移技术获得工程菌株。研究结果表明,工程菌株摇瓶效价(14580 u/mL)比出发菌株(11318 u/mL)提高了29%;液相色谱结果显示,工程菌株的泰乐菌素A和泰乐菌素C相对峰面积显著(P≤0.05)高于出发菌株。增加弗氏链霉菌tylF、tylE和tylCV的拷贝数可有效提高泰乐菌素的产量,以及优化组分,为泰乐菌素生产菌的遗传改造提供参考。     

一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析

为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str~S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan~R),采用重叠延伸PCR方法将str~S基因和kan~R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr~S-kan~R打靶片段和Parastr~S-kan~R打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。     

常温常压等离子体诱变选育安普霉素高产菌株

安普霉素作为一种广谱兽用抗生素，对多种革兰氏阴性菌、阳性菌和某些支原体具有较好的抗菌作用。本论文利用常温常压等离子体(ARTP)技术结合抗性筛选方法，对安普霉素产生菌黑暗链霉菌进行诱变选育，以期得到高产菌株。以AP-520为出发菌，进行ARTP诱变处理，ARTP最佳诱变时间是70 s,处理后的菌液在潮霉素平板上进行抗性筛选，单菌落经过48孔板大量筛选后再进行摇瓶初筛和复筛，共进行8轮筛选试验，得到一株高产菌株AP-6023,摇瓶效价达到11444 U·ml^-1,较对照提高29%,经过10次传代培养后仍能保持产抗能力，30 L发酵罐效价为10920 U·ml^-1,较对照提高23%。突变株AP-6023的获得，大大提高了安普霉素的生产水平，证实了ARTP诱变技术的有效性，试验方法为其它工业微生物的育种提供了解决思路。     

粘杆菌素高产菌株的选育

以多粘芽胞杆菌BT-163为出发菌株,采用诱变与定向筛选相结合的方式,即根据粘杆菌素生物合成途径的调控机制和本身的分子结构特点,选用重金属离子和氨基酸结构类似物进行筛选,获得高产突变株。这些突变株比原菌株生产能力高出60%以上,并应用在大规模发酵生产中。平均效价从430000u/mL提高到630000u/mL。     

饲用木聚糖酶菌株的筛选及鉴定

利用刚果红透明圈法,从采集的土样中筛选分离一株产木聚糖酶的菌株,根据其形态学和生理生化特征,结合16 SrDNA分子水平分析,鉴定该菌为短小芽孢杆菌。摇瓶发酵粗酶液的性质测定表明,该菌株酶活力可达132.53 IU/mL。     

菊芋内生固氮菌分离、鉴定及特性研究

通过气相色谱,结合乙炔还原法,对菊芋根系的内生固氮菌进行了分离和鉴定。结果表明,筛选得到的7株具有固氮酶活性的菌株,分别属于根瘤菌属,寡养单胞菌属,假单胞菌属和肠杆菌属。菌株之间固氮酶活性相差较大,固氮酶活性较高的菌株较少,100 nmol/(mL·h)以上的只有cho1和cho9两株菌。菌株cho4的耐盐性较高,可以在盐浓度为7%的条件下正常生长。分离得到的菌株中,有5株具有解磷活性,其中以菌株cho7的活性最高,为63.84 μg/mL。菌株全部都具有分泌生长素的能力,但差异较大,分泌IAA浓度最高的是cho2,达到13.49 μg/mL。     

5株H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析和豚鼠间传播能力的评估

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在哺乳动物间的传播能力,本研究以豚鼠为模型评价了5株H9N2亚型AIV在豚鼠体内的复制能力和水平传播能力,并分析了5株病毒血凝素(HA)蛋白的分子特征。结果表明,5株病毒均属于CK/Beijing谱系,其中2株病毒的HA具有人样受体特征(Lys226),2株病毒具有禽样受体特征(Gln226),而A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)株在该位点的氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe226)。裂解位点分析表明,5株病毒均具有低致病性AIV特征。个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。感染试验表明,5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制。并且在鼻甲骨处复制稳定,平均病毒滴度为2.01 Log EID50/mL～4.5 Log EID50/mL。传播试验表明,所有病毒株的人工接种豚鼠的鼻洗液中均能够检测到病毒,最长排毒期为接毒后第8 d,而接触组豚鼠鼻洗液中未检测到病毒。本研究表明,5株H9N2亚型AIV均属于CK/Beijing谱系,部分病毒株的HA蛋白已具备人样受体结合特征,并且关键氨基酸位点(226位)处出现新的突变。5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制并通过上呼吸道排毒,但不能在豚鼠间同群传播。     

4株NDV流行株的分离鉴定、生物学特性及遗传学特性的研究

为研究近年国内的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株与传统疫苗株（Mukteswar、La Sota及Clone 30）的亲缘关系和遗传演化情况,试验从广东、广西和海南地区患病的免疫鸡群病料中分离鉴定得到4株NDV流行株。通过RT-PCR技术对各毒株的F和HN基因进行扩增、克隆与序列分析,然后与GenBank上发表的NDV序列进行同源性比对、遗传进化树分析,并测定各毒株致病指数。结果显示,本试验中HN-08株的鸡胚半数感染量（EID₅₀）、平均死亡时间（MDT）、脑内致病指数（ICPI）和静脉致病指数（IVPI）分别为10^-8.37/0.2 mL、58.5 h、1.78和2.45,XX-08株分别为10^-6.50/0.2 mL、75.0 h、1.61和2.41,YS-09株分别为10^-7.75/0.2 mL、64.5 h、1.71和2.38,LF-09株分别为10^-7.60/0.2 mL、63.8 h、1.84和2.38。4株鸡源NDV流行株彼此间F和HN基因推导的氨基酸序列同源性在95.8%以上,与鸡源流行株GX11/03、GM株的同源性为96.8%~98.6%,而疫苗株Mukteswar、La Sota及Clone 30株的同源性为86.7%~90.6%,与标准强毒株F₄₈E₉的同源性为88.4%~91.3%。表明4株NDV流行株均为强毒株,与近年来国内流行的GX11/03、GM株有较近的亲缘关系,而与传统疫苗株的关系相对较远。     

Isolation,Identification of Four Newcastle Disease Virus Strains and Study on Their Biological Characteristics and Genetic Characteristics

In order to study the relationship and evolution between the latest Newcastle disease virus (NDV) epidemic strain and the vaccine strain (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains),four NDV epidemic strains were initially isolated and identified from immunized chicken groups in Guangdong,Guangxi and Hainan provinces. Fusion (F) gene and hemaglutinin neuraminidase (HN) gene of four isolated stains were amplified,cloned and sequenced by RT-PCR method,and the homology analysis of amino acid sequences deduced by F and HN genes of NDV and other strains published in GenBank were studied, the phylogenetic tree were build,and the pathogenicity index of each strain (EID₅₀,MDT, ICPI and IVPI) were determined. The results showed that the EID₅₀,MDT,ICPI and IVPI of the HN-08 strain were 10^-8.37/0.2 mL,58.5 h,1.78 and 2.45,that of the XX-08 strain were 10^-6.50/0.2 mL,75.0 h,1.61 and 2.41,that of the YS-09 strain were 10^-7.75/0.2 mL,64.5 h,1.71 and 2.38,and of the LF-09 strain were 10^-7.60/0.2 mL,63.8 h,1.84 and 2.38.In this experiment,the similarity of amino acid sequences of F and HN genes was over 95.8% among four strains of NDV isolated from chicken,the similarity of four NDV strains with chicken epidemic strains (GX11/03 and GM strains),vaccine strains (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains) and standard virulent strain (F₄₈E₉ strain) were from 96.8% to 98.6%,86.7% to 90.6% and 88.4% to 91.3%,respectively. The results showed that four NDV epidemic strains were virulent strains,which were closely related to the GX11/03 and GM strains that were popular in China in recent years,but relatively far from the traditional vaccine strains.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA株分离及主要结构基因的克隆和序列分析

近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致。本研究从病猪中采集材料,经RT-PCR检测为阳性后,接种于Marc-145细胞,经过6代盲传,发现典型的细胞病理变化(CPE),经鉴定为PRRSV,命名为GXA株,其毒价为105.33TCID50/mL。参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对特异性引物,分别对GXA株的E、M、N基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。应用DNAstar生物学软件拼接得到GXA株的E、M和N3个基因片段共长为1473bp。同源性分析表明,GXA株与VR-2332、MLV和BJ-4的同源性为99.7%～100%,而与欧洲型代表株LV的同源性只有66.4%。表明GXA与VR-2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切,与欧洲型代表株LV亲缘关系最远,属于美洲型毒株,有可能来源于疫苗株。     

结缕草根际联合固氮菌培养条件研究

以结缕草根际土壤中筛选得到的5株联合固氮菌为试验材料,对其培养条件以及典型生长曲线开展研究。结果表明,菌株在10～45℃均可生长,最适生长温度在20～30℃;最适生长初始pH值在7.0～7.5;菌株N4、N5、N6、N8的最佳通气量为220mL,菌株N1最佳通气量为200mL;并在上述基础上经过进一步试验得到了菌株的典...     

2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

为了解山东省禽腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料（肝脏、脾脏）进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞（LMH）进行毒株传代培养和细胞病变（CPE）观察、PCR检测、TCID₅₀测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500 bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID₅₀分别为10^-7.75/0.1 mL和10^-7.60/0.1 mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高（99.57%）,第2分离株与FAdV-8b株同源性最高（99.18%）。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒（HEV）所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒（EDSV）所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

犬冠状病毒JS1706和JS1712毒株基因组3'端分子特性分析

为了全面了解犬冠状病毒（CCoV）分离毒株JS1706和JS1712基因组3'端主要结构蛋白基因和非结构蛋白基因的分子特征,本研究设计了8组引物进行RT-PCR扩增,产物经测序和拼接后,获得了约8.7 kb基因组片段,该基因组结构及其编码蛋白顺序为5'-S-3abc-E-M-N-7ab-3'。对CCoV JS1706、JS1712株8.7 kb基因组核苷酸序列与α冠状病毒属参考毒株的相同区域核苷酸序列进行比对,结果表明,2个分离株与CCoV Ⅱ型参考毒株相似性最高（83.4%~93.1%）,其次为FCoV Ⅱ型参考毒株（87.1%~87.9%）、TGEV参考毒株（86.1%~86.8%）、CCoV Ⅰ型参考毒株（72.0%~72.1%）和FCoV Ⅰ型参考毒株（67.5%~69.9%）。JS1706、JS1712毒株与同属冠状病毒参考株的结构蛋白S、E、M和N蛋白氨基酸相似性分别为46.4%~95.2%、75.6%~100%、82.8%~99.2%和78.5%~99.7%。说明同属内冠状病毒的S基因变异度大,E、M、N基因相对保守。根据基因组3'端8.7 kb核苷酸序列和S蛋白氨基酸序列相似性比对结果,JS1706和JS1712毒株均与泛嗜型原型株CB/05相似性最高,分别为93.0%~93.1%、94.8%~95.2%,其他结构蛋白包括E、M和N氨基酸序列比对也发现与CB/05株的相似性较高,分别为97.6%~100%、92.4%~93.1%和97.9%。S蛋白氨基酸序列的进一步分析表明,JS1706和JS1712毒株的S蛋白N端有一些特有氨基酸,S蛋白氨基酸序列中没有明显的S1/S2蛋白酶切位点（RRARR）,但在958—963位氨基酸有S2'裂解位点特征基序（KRKYRS）。基于S蛋白氨基酸序列构建的系统发育进化树分析显示,CCoV JS1706和JS1712株与CCoV Ⅱa亚型参考毒株和FCoV Ⅱ型参考毒株聚集形成一个分枝。CCoV JS1706和JS1712株非结构蛋白的编码基因ORF3abc和ORF7,其结构、大小与经典疫苗株INSAVC-1相似,无明显插入、缺失和移码突变。本研究有助于深入了解国内CCoV流行毒株的分子特性,为后续分子流行病学调查、诊断试剂和疫苗研发奠定了基础。     

鸭源新城疫病毒的分离鉴定

从病死肉鸭肝脏中分离到2株病毒(ZH1、ZH2),均能够凝集鸡、肉鸭、绵羊、山羊、猪、人、兔、牛等的红细胞,且这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制.参照NDV毒力判定标准及其方法对分离毒株ZH1、ZH2进行了鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID50)以及1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定,结果ZH1、ZH2株的MDT为52 h和44 h,EID50为106.4/0.1mL和108.64/0.1mL,ICPI为1.93和1.975.表明这2株分离病毒均为NDV强毒株.