穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

pMCLacⅠ/Neo质粒的构建和基因突变研究的新策略

目的：构建一个用于比较研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的不同突变机制的质粒载体。方法和结果：设计并构建一种具两个lacⅠ突变靶基因的突变研究载体：pMCLacⅠ/Neo质粒。在该质粒中,一个lacⅠ靶基因受CMV启动子的驱动而使其在人和哺乳动物细胞内能表达,而另一个lacⅠ靶基因则不能表达。将所获得的pMCLacⅠ/Neo质粒经酶切鉴定后,再进行如下功能鉴定：一是分析两个lacⅠ靶基因在大肠杆菌细胞内的功能状态,结果显示这两个lacⅠ基因在DH5α宿主菌内功能正常;二是将其导入NIH3T3细胞内,分析两个靶基因是否能模拟哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的功能状态。结果表明其中一个lacⅠ靶基因在NIH3T3细胞中处于转录表达状态。结论：本研究构建了一种新型的突变研究载体,位于该载体上的两个lacⅠ靶基因能模拟人和哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的功能状态。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）部分失的真核表达质粒。方法：利用线性化的,从CP上游顺序列始且含完整转录单元的HBV基因克隆（P3．8I质粒）为工具,采用分子克隆,人工定点突变,PCR－PFLP鉴定和测序分析等技术构建目载体。结果：成功构建了HBV全基因CP20／21个bp缺失（nt1748/1747-1767)和CP20／21个bp缺失＋1896热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经PCR－RFLP序列分析证实。结论：此重组真核表达质粒构建可为体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

PET32a-CDK2重组质粒的构建与表达

目的 构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的PET32a-CDK2重组质粒,利用原核表达体系表达CDK2蛋白.方法 从人白细胞中提取总RNA, 采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆.将克隆得到的PET32a-CDK2重组质粒转化...     

TAZ基因重组质粒的构建与表达

目的构建重组质粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-pEGFP-C2,并应用Western Blot检测TAZ蛋白在细胞内的表达情况,初步探索TAZ分子促进细胞增殖和迁移的作用机制。方法通过PCR扩增获得TAZ基因片段,胶回收后连接T载体,蓝白斑筛选,转化,提质粒,酶切,用T4DNA Ligase连接,亚克隆进入pEGFP-C2和pcDNA3.1获得新的重组质粒,分别转染HEK293细胞,智能型荧光细胞监测仪观察TAZ分子在细胞内的分布情况,Western Blot检测其在细胞内的表达情况。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序证明构建成功,荧光照片显示TAZ分子分布在细胞核和细胞浆中,Western Blot检测结果表明转染有重组质粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293细胞中有大量TAZ蛋白表达。结论成功构建了两种重组质粒,并初步验证了TAZ蛋白的细胞定位,为进一步研究其促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。     

EMS对穿梭质粒pZ189诱变作用的初步研究

Shuttle vector plasmid pZ189 was used as a molecular tool and the SupF inserted in the plasmid was worked as a target gene for mutagenesis study. The host cells (E. coli MBM 7070) with pZ189 were treated with ethylmethane sulfonate (EMS) and plated on the selective media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) and IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside). The SupF and the LacZ amber mutant carried by the host cells complemented each other and thus made the colonies blue on the selective media. However the colonies derived from the SupF mutants changed the colour from blue to white. The mutant frequencies in a series of experiments with different concentrations of EMS were estimated. Furthermore, the DNA isolated from 5 SupF mutants was digested with restruiction enzyme Hha I. It suggests that the 214 bp Hha I fragments containing mutant SupF could be distinguished from their wild type counterparts by temperature-gradient gel electrophoresis under optimal conditions.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达(英文)

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获得质粒pMVZ2A,将其电转化卡介苗,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其结果进行分析。结果信号序列与LMP2A和BZLF1融合基因被正确插入分泌表达载体pMV261。重组质粒经限制性内切酶双酶切、PCR扩增、基因测序等鉴定。蛋白纯化后可得到一条带。结论 pMVZ2A在BCG中能够分泌表达,本研究为获得抗结核杆菌和EB病毒的双价疫苗奠定了基础。     

腺病毒穿梭质粒pAdCMVlacZ的构建及鉴定

目的 为了构建复制缺陷型腺病毒AdCMV—lacZ，我们首先构建了腺病毒穿梭质粒PAdCMVlacZ。方法 将含lacZ cDNA基因克隆到腺病毒穿梭质粒PAdCMV的Hind Ⅲ和Hind Ⅲ位点。结果 PAdCMVlacZ经双酶切鉴定图谱正确，在含诱导剂和X—gal的氨苄平板上显示蓝色菌落。结论 成功构建了pAdCMVlacZ。     

分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定

目的 用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定.方法 以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的Apa Ⅰ位点与SnaB Ⅰ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M. smegmatis)mc2 155中的表达情况.结果 从BCG基因组中扩增出160 bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致.测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M. smegmatis中成功表达.结论 成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70.     

Kringle 5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建

目的：构建含有目的基因kring5的真核植物细胞穿酸表达载体。方法：应用RT－PCR方法，从正常人肝脏组织中获得kringle5基因，测序后，再通过DNA重组技术，将kringle5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI121和pCAMBIA3301上。结果：得到的kringle5基因序列测定结果与文献相符，重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确，含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论：重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制，而且可以在植物细胞中表达。     

pSITITIN载体的构建及表达

目的构建能阻断Wistar大鼠肌联蛋白表达的siRNA载体,为研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化的过程中肌小节结构蛋白之间的相互关系打下基础.方法针对Wistar大鼠TITIN N2B区设计并构建重组质粒pSITITIN,针对人β-ACTIN设计并构建重组质粒pSIACTIN,利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养1周的新生大鼠心肌细胞和经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后2周的MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白的表达.结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞和经5-aza处理后的MSCs后,肌联蛋白的表达均减弱(P＜0.01);而转染pSIACTIN后不影响肌联蛋白的表达.结论 pSITITIN具有确切阻断肌联蛋白表达的效果.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

辐射诱导人TRAIL基因表达的腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的：构建辐射敏感Egr-1启动子诱导人肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。方法：利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法从pACCMV-hTRAIL质粒中扩增得到TRAIL基因片段,并将其连接到pMD19T载体进行测序,利用基因重组技术构建含有辐射诱导启动子Egr-1的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。结果：PCR扩增出约820 bp的片段,测序结果证实扩增片段的序列与GenBank公布（NM_003810）的一致。pshuttle-Egr1-hTRAIL用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切重组得到大小为3 540和4 299 bp的2个片段,用SmaⅠ酶切得到1 517、2 282和4 040 bp 的3个片段,用BamHⅠ酶切得到3 304和4 535 bp的2个片段,与预期结果完全一致。结论：成功克隆了hTRAIL基因,并构建了辐射诱导表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。