联合应用硫化砷和α干扰素对K562细胞的作用

目的:研究联合应用硫化砷和α干扰素是否可以增强对K562细胞的作用.方法:采用PCR-ELISA法测定端粒酶活性;流式细胞仪分析细胞凋亡.IFN-α和硫化砷的终浓度分别均为10 000 u/mL和0.6 mg/L.结果:单独应用IFN-α或硫化砷8 d,可以诱导37.8%和37%的K562细胞出现凋亡;同时应用IFN-α和硫化砷8 d或先单独应用IFN-α 3 d,再单独应用硫化砷5 d,K562细胞的凋亡率分别为59.9%和60.37%;端粒酶活性的抑制,单用硫化砷为71.3%,联合用药分别为81.2%和78.8%.结论:联合应用IFN-α和硫化砷较单独用药相比,可以显著提高K562细胞的凋亡,抑制细胞端粒酶活性.提示IFN-α司能促进硫化砷诱导K562细胞凋亡.     

hTERT反义寡核苷酸促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡

目的：探讨转染人端粒酶逆转录酶基因（hTERT)反义寡核苷酸后能否增强紫杉醇诱导皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78凋亡。方法:采用脂质体介导的基因转染技术将hTERT反义寡核苷酸（AODN)、正义寡核苷酸（SODN)导入Hut78细胞株中，应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应、四甲基偶氮唑蓝法（MTT)、台盼蓝拒染法和流式细胞仪分析测定联合应用紫杉醇后对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、细胞增殖及凋亡的影响。结果:转染hTERT基因反义寡核苷酸并联合应用紫杉醇，48 h后Hut78细胞增殖即被明显抑制，端粒酶活性下降，hTERT mRNA表达降低，分别同SODN联合紫杉醇组及单用紫杉醇组进行比较，有显著差异（P<0.05)； MTT结果显示，紫杉醇对AODN组、SODN组及空白对照组细胞的IC50值分别为(81.10 ± 1.68) nmol/L，(138.70±1.80) nmol/L和(139.40± 5.50) nmol/L，差异显著（P< 0.05)；经流式细胞仪检测，AODN联合紫杉醇组凋亡率明显高于SODN联合紫杉醇组和单用紫杉醇组。结论:hTERT反义寡核苷酸与紫杉醇有协同抗肿瘤效应，并能增加Hut78细胞对紫杉醇的敏感性，促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡。     

冬凌草甲素对急性白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及其作用机制

目的探讨冬凌草甲素对急性白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及其作用机制。方法以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的HL-60细胞，MTr法检测细胞生长抑制率，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，瑞氏染色法观察细胞凋亡时的形态学变化。应用PCR．ELISA及RT—PCR法检测细胞凋亡前后端粒酶活性及端粒酶hTERT mRNA表达水平的变化。结果冬凌草甲素可显著的抑制HL-60细胞的生长，诱导细胞发生凋亡，并呈现出明显的量-与时-效关系。冬凌草甲素作用48—60h后在瑞氏染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，同时端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性均明显降低。结论冬凌草甲素能抑制HL-60细胞的生长及诱导细胞发生凋亡：降低端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性可能是其重要作用机制之一。     

姜黄素抑制HeLa细胞端粒酶的活性

目的研究姜黄素能否抑制HeLa细胞端粒酶活性。方法用MTT法检测姜黄素对HeLa细胞生长的抑制作用,用RT-PCR和半定量TRAP-ELISA法检测HeLa细胞中人端粒酶催化亚基(hTERT)mRNA的表达和端粒酶活性。结果HeLa细胞生长呈剂量依赖性抑制,其端粒酶活性和hTERT的表达也明显下调。结论姜黄素可能通过下调hTERT的表达而抑制HeLa细胞的端粒酶活性。     

三氧化二砷诱导Raji细胞凋亡过程中端粒酶活性和hTERT、bcl-2基因表达的研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）诱导Raji细胞凋亡并初步探讨端粒酶活性、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及bcl-2基因表达之间的关系。 方法： 通过姬姆萨染色来观察细胞的凋亡；以RT-PCR分析bcl-2、hTERT基因的mRNA表达水平；利用半定量多聚酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)方法检测As2O3处理Raji细胞前后端粒酶活性的改变。 结果： 2 μmol/L As2O3能诱导Raji细胞凋亡，2 μmol/L As2O3作用于Raji细胞8 h、12 h、24 h hTERT mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异（P＜0.05）， 12 h、24 h bcl-2 mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异。2 μmol/L As2O3作用48 h后，Raji细胞中端粒酶活性即出现下降，作用72 h、96 h，端粒酶的活性明显受到抑制，吸光度分别为0.829、0.328、0.291，分别与空白对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论： As2O3诱导Raji细胞凋亡过程中，端粒酶活性下调与hTERT、bcl-2基因mRNA表达下降有关。     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核酸促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制HL-60细胞的端粒酶活性后,探讨顺铂对HL-60细胞凋亡的影响。方法:采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法检测人工合成的反义核酸处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变;免疫荧光标记通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达水平;用DNA电泳及流式细胞仪计数检测细胞凋亡。结果:hTERT基因的ASODN作用于HL-60细胞后,细胞的hTERT蛋白表达及端粒酶活性表现不断降低;抑制HL-60细胞端粒酶活性后,顺铂可诱导HL-60细胞产生明显的DNA断片;ASODN与顺铂联合作用于HL-60细胞后的凋亡细胞百分率(38.62±3.45)%分别同正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组(11.02±2.07)%、单用顺铂作用组(9.23±1.70)%进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论:hTERT基因的ASODN能促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

互补于hTERT关键区段的反义RNA抑制肝癌细胞

目的研究针对人类端粒酶催化亚单位(hTERT)调控区C-MYC结合位点的反义RNA抑制肝癌细胞生长。方法细菌内同源重组构建反义RNA腺病毒(rAd-asmycb),转染HepG2.2.15肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜下观察凋亡细胞形态,聚合酶链反应-酶联免疫分析(PCR-ELISA)、逆转录-PCR(RT-PCR)分别检测细胞端粒酶活性及mRNA水平上hTERT表达。结果反义RNA抑制肝癌细胞生长,细胞凋亡率为40.7%,显示特征性凋亡细胞形态,能够显著降低细胞端粒酶活性,在mRNA水平上抑制hTERT表达。结论hTERT调控区C-MYC结合位点可能是肝癌基因治疗的有效靶位。     

长春瑞滨诱导人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

目的探讨长春瑞滨对人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3细胞凋亡、端粒酶活性及亚单位人端粒酶反转酶mRNA(hTERT mRNA)表达的影响。方法将不同浓度的长春瑞滨作用于SKOV3细胞后,用CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞凋亡;端粒重复序列扩增酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性;RT-PCR检测细胞中hTERT mRNA表达。结果长春瑞滨可抑制SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡(P<0.01),降低SKOV3细胞中端粒酶活性及hTERT mRNA的表达(P<0.01),且存在浓度-时间依赖关系。结论检测端粒酶的活性及hTERT mRNA表达,可能有助于判定长春瑞滨诱导上皮性卵巢癌细胞凋亡的敏感性。     

三氧化二砷对K562细胞端粒酶活性及P53蛋白表达水平的调节

目的：研究三氧化二砷(As2O3)诱导急性白血病K562细胞的凋亡机制。方法：以不同浓度的As2O3作用于体外培养的K562细胞，检测细胞生长抑制率，观察细胞凋亡时的形态学变化，对细胞端粒酶活性及P53蛋白的表达水平进行检测。结果：As2O3可显著地降低K562细胞端粒酶活性，升高P53蛋白的表达水平，抑制细胞的生长，诱导细胞发生凋亡。并呈现出明显的量-效与时-效关系。结论：As2O3能抑制K562细胞的生长并诱导细胞发生凋亡，降低细胞端粒酶活性及升高P53蛋白的表达水平是其重要作用机制之一。     

人端粒酶hTERT可诱导RNAi系统的建立及其对TREx-HeLa细胞生长的影响

目的：建立可诱导性沉默hTERT的 RNA干扰系统，并初步探讨端粒酶与细胞增殖调控之间的关系。方法: 构建沉默端粒酶催化亚基hTERT的Tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA，并稳定转染表达TR的TREx-HeLa细胞，用半定量RT-PCR检测hTERT的转录后水平，TRAP法检测端粒酶活性。MTT法检测细胞的增殖，流式细胞仪和Hoechst33342染色法观察细胞凋亡。结果: 构建了可诱导性沉默端粒酶催化亚基hTERT的重组体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA，并建立了可诱导性沉默hTERT的TREx-HeLa细胞株。短期内的端粒酶活性降低后TREx-HeLa细胞生长增殖有下降趋势，而其凋亡情况则未见明显变化。结论: 本研究建立了可诱导沉默hTERT的RNAi系统，为研究端粒酶活性与细胞增殖和衰老的关系提供了实验基础。     

对比硫化砷对两种白血病细胞株凋亡和hTERT-mRNA表达的影响

目的:对比硫化砷对慢性粒细胞白血病细胞株K562和急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4两种细胞的作用是否存在差异及其机制.方法:PCR-ELISA法测定端粒酶活性;半定量RT-PCR检测hTERT mRNA的表达;流式细胞术测量细胞周期、凋亡.结果:0.15～0.6 mg/L硫化砷(72 h)可在诱导NB4细胞凋亡的同时,下调细胞端粒酶活性和hTERT-mRNA表达,同样作用对于K562细胞需要硫化砷浓度达到0.3～3 mg/L.0.3 mg/L硫化砷(72 h)可引起NB4细胞出现G2/M期细胞比例增高.而K562细胞需要在1.5mg/L硫化砷诱导下出现G2/M期细胞比例增高.结论:端粒酶系统可能是硫化砷诱导NB4和K562细胞凋亡的途径之一;由硫化砷诱导的G2/M期阻滞可能与端粒酶活性的显著下降相关.NB4和K562细胞对硫化砷的敏感性存在明显差异,具体机制有待进一步研究.     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

hTERT基因反义核酸对化疗药物诱导CEM细胞凋亡的影响

目的：利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制人T淋巴细胞白血病细胞株(CEM)端粒酶活性后，探讨化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对CEM细胞凋亡的影响。方法： 采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对CEM细胞系生长的影响；姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化；通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果： hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙，对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比，统计学上无显著差异(P＞0.05)。hTERT反义核酸作用于CEM细胞24 h加入顺铂，再共同作用48 h，CEM活细胞均数为2.318×108 cells/L，与单用顺铂组(3.250×108 cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(3.175×108 cells/L)相比，对细胞抑制明显增强(P＜0.05)。hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入顺铂作用48 h，细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于CEM细胞48 h的凋亡细胞百分率(19.47%)分别同SODN与顺铂联合作用组(6.97%)、单用顺铂作用组(6.02%)进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论： hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导CEM细胞凋亡。     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)端粒酶活性的抑制作用及其可能机制。方法:MTT法检测不同浓度的EOS对CNE-2Z细胞增殖能力的影响;端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测各组细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达,Western blotting检测c-Myc蛋白表达。结果:EOS对CNE-2Z细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.01);EOS处理组CNE-2Z细胞端粒酶的活性、hTERT mRNA和c-Myc蛋白的表达水平均低于对照组(P0.01),也呈剂量依赖性,并且hTERT mRNA的下调与c-Myc的抑制存在相关性(P0.05)。结论:EOS可能通过下调细胞c-Myc表达而抑制了hTERT mRNA的转录,以致端粒酶的活性降低而抑制CNE-2Z细胞增殖。     

端粒酶在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的 研究高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT)对HL－60细胞端粒酶活性的影响及诱导凋亡作用。方法 采用端粒重复序列扩增法－酶联免疫吸附试验检测了HL－60细胞的端粒酶活性变化；用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和DNA片段原位末端标记法检测了细胞凋亡现象。结果 0.005-0.50μg/ml HHT处理HL－60细胞0－48小时，HL－60细胞端粒酶活性呈剂量依赖性和时间依赖性下降。同时，HL－60细胞发生了凋亡。结论 HHT有效抑制HL－60细胞的端粒酶活性，诱导细胞凋亡。     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

抑制白血病K562细胞FoxM1表达可增强细胞对高三尖杉酯碱的敏感性

目的:探讨抑制白血病K562细胞叉头框蛋白M1(Fox M1)是否增强细胞对高三尖杉酯碱(HHT)的敏感性。方法:HHT以不同浓度(0、0.015、0.030和0.045μmol/L)和最低起效浓度不同时间(0.015μmol/L,0、24、48和72 h)作用于K562细胞,real-time PCR和Western blot检测Fox M1 mRNA和蛋白表达;以0.015μmol/L HHT作用K562细胞后转染Fox M1 siRNA,观察沉默K562细胞Fox M1后细胞对HHT的敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及Fox M1相关靶分子c-Myc和Sp1表达状况。结果:随着HHT浓度增加和时间延长Fox M1表达逐渐降低,说明HHT抑制K562细胞Fox M1表达;HHT处理K562细胞后转染Fox M1 siRNA,细胞生长和克隆形成显著下降,细胞凋亡增加,因此抑制Fox M1可增加K562细胞对HHT的敏感性;Fox M1 siRNA组c-Myc和Sp1表达显著降低,表明Fox M1可正性调控c-Myc和Sp1表达。结论:HHT可以抑制白血病K562细胞Fox M1表达,干扰Fox M1可增强细胞对HHT的敏感性。     

AML患者端粒酶逆转录酶mRNA的表达与端粒酶活性的检测

目的:建立一种实时荧光RT-PCR方法,定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者外周血单个核细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达水平,观察其与AML发生及复发的关系,探讨hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性的相关关系。方法:采用实时荧光RT-PCR与Lightcycler荧光PCR仪定量检测hTERT mRNA的表达水平,采用PCR-ELISA检测端粒酶活性。结果:①AML首治患者、复发患者、完全缓解期患者以及健康体检者NhTERT分别为299.2±292.8、550.1±441.3、14.0±9.2和12.3±6.7,与健康体检者和完全缓解期患者比较,AML首治患者、复发患者hTERT mRNA表达水平显著升高,而且AML复发患者hTERT mRNA的表达水平显著高于首治患者;②AML首治患者、AML复发患者、AML完全缓解期患者以及健康体检者端粒酶的活性分别为32.8%±24.3%4、8.6%±31.4%、7.4%±5.1%和7.6%±3.6%,AML首治患者、复发患者端粒酶活性显著升高,而且AML复发患者端粒酶活性显著高于首治患者;③hTERT mRNA表达水平与端粒酶的活性呈现良好的相关性,相关系数为0.78。结论:hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性的上调是AML发生与复发的一个重要因素,且hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性呈良好的正相关。