桃果实酰基辅酶A氧化酶活性检测方法的建立

采用可见分光光度法,以棕榈酰辅酶A为底物,研究了桃果实中酰基辅酶A氧化酶(ACOX)的活性检测方法。结果表明,桃果实中ACOX活性检测体系的参数为:150 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液,pH值7.5,温度30℃,吸收波长500 nm。     

油菜长链酰基辅酶A合成酶基因(LACS4)的电子克隆和表达分析

长链酰基辅酶A合成酶 (LACSs)把游离脂肪酸活化成为酰基辅酶A硫脂,在油脂的合成和降解途径中发挥着重要的作用.通过电子克隆的方法,发现了1个油菜(Brassica napus)LACS基因.该基因长 2 270 bp,包含2 004 bp的开放阅读框,预测编码1个含有667个氨基酸残基的蛋白质,命名该蛋白为BnLACS4,序列分析显示,BnLACS4具有典型的LACS分子特征.表达分析显示BnLACS4在成熟油菜的根、茎、叶和花中都有表达.在授粉后(DAP)35 d, 不同含油量的角果皮和种子中,BnLACS4的表达也存在差异.表达谱说明,BnLACS4可能参与油脂的生物合成以及油菜种子中的油脂积累.     

花生长链酰基辅酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鉴定与组织表达

长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase:LACS)是油脂代谢的重要催化酶。为揭示花生脂肪酸代谢机理,采用RT-PCR技术,首次从花生Arachis hypogaea L.克隆到LACS6(GenBank登录号:KU301860),分析该基因的结构组成,预测编码氨基酸与其他植物的同源性,采用Real-Time PCR技术对LACS6的组织表达进行研究。结果显示,花生LACS6基因全长2 116bp,包含2 088bp的ORF,编码695个氨基酸,有23个外显子和22个内含子。氨基酸序列比对显示花生LACS6有真核生物酰基辅酶A合成酶保守结构域,并含有保守的激活位点和绑定位点。同源性分析发现花生LACS6与鹰嘴豆、绿豆、大豆、梅等13种物种的氨基酸一致性在79%~87%,进化树分析显示,花生LACS6与鹰嘴豆等豆科植物亲缘较近。实时荧光PCR分析表明,花生LACS6在花生根、茎、叶、子房柄、仁和花等组织均有表达,且差异明显。子房柄和花的表达量极高,与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异,花生LACS6组织的表达量大小排序为花子房柄叶仁茎根。本研究结果为揭示花生脂肪酸代谢和品质改良提供理论依据。     

酰基辅酶A硫酯酶11基因(ACOT11)及其家族的研究进展

酰基辅酶A硫酯酶(ACOTs)是一类催化脂肪酰基辅酶A水解形成游离脂肪酸(FFA)和辅酶A(CoA)的酶.这类酶通过维持细胞内的FFA、脂肪酰基辅酶A以及CoA的适当水平在脂质代谢中发挥了非常重要的作用.ACOT11作为ACOTs家族成员之一,对温度和摄食量的变化较为敏感,所以该基因对生物体的能量保存、炎症的调节和内质...     

玉米长链酰基辅酶A合成酶1基因鉴定及其蛋白磷酸化位点检测

【目的】对玉米中长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)基因及其蛋白磷酸化位点进行鉴定,为研究玉米脂肪酸的降解及其利用机制奠定基础。【方法】通过结构域分析查找质谱鉴定到蛋白中的长链酰基辅酶A合成酶1,通过系统发育树分析判断玉米中长链酰基辅酶A合成酶1与拟南芥超家族中长链酰基辅酶A合成酶的同源性,通过质谱分析鉴定该蛋白的磷酸化修饰位点。通过3D建模模拟长链酰基辅酶A合成酶1的结构以及磷酸化位点所在位置。【结果】玉米长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)与拟南芥中的长链酰基辅酶A合成酶1(AtLACS1)具有高度同源性;通过质谱分析鉴定到3个该蛋白的磷酸化位点分别为S360、Y365和S366,同时鉴定到的磷酸化位点位于长链酰基辅酶A合成酶的保守结构域(AMP-binding domain)中,3个磷酸化位点位置一致,位于两个α螺旋中间,处于蛋白结构的关键位置。【结论】磷酸化修饰可能是调节长链酰基辅酶A合成酶1功能的关键性方式之一,ZmLACS1可能与AtLACS1在功能上具有相似性。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

茶树‘紫娟’肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR）克隆及序列分析

通过克隆茶树肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列,为研究其蛋白结构和功能奠定基础。对利用cDNA-AFLP技术获得的‘紫娟’茶树成熟叶片上调的差异表达片段TDF,设计特异引物,利用RACE末端扩增技术,分别扩增出5′端和3′端目的片段,测序后进行拼接获得茶树肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)cDNA全长序列,并进行序列分析。结果表明:克隆的茶树CsCCR基因cDNA全长1 259bp(GenBank登录号为KJ995737),其中开放阅读框957bp。同源比对发现,与蓖麻、丹参、草莓、番茄的CCR蛋白同源性分别为67%、68%、69%和70%。     

酸橙ACC氧化酶基因片段克隆及序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶是植物乙烯合成的1个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据已报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,以酸橙叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到1个834 bp的基因片段。克隆了酸橙1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因cDNA片段,将片段序列在NCB I网站上进行同源性搜索,显示的皆为不同植物的ACC氧化酶基因,因而认为所克隆的片段就是酸橙ACC氧化酶基因;并运用DNAStar5.0软件进行序列分析,推导的氨基酸序列为278个残基;具有所有植物ACC氧化酶基因共有的保守区域;与多种植物的ACC氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在72%和70%以上。     

绵羊TTF-1基因分子克隆及序列分析

以经产小尾寒羊母羊基因组DNA为模板,利用特异性引物对P1和P2对绵羊甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因进行扩增,克隆入pGEM-T载体.转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的TTF-1基因序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果表明,扩增的绵羊TTF-1基因序列长度为1 459 bp,包括部分外显子1、外显子2序列以及内含子,共编码174个氨基酸.该基因与GeneBank报道牛、狗、猪、人、和小鼠的基因序列同源性分别为98.7%、98.3%、97.5%、96.6%和96.6%.内含子与猪、人、鼠的内含子同源性为83.7%、74.9%和59.5%.     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

文昌鸡PRL基因的克隆及序列分析

为研究文昌鸡催乳素基因的分子生物学特性和就巢机理,提取文昌鸡全血总DNA,利用特异性引物PCR技术获得文昌鸡PRL基因,将其克隆至pGM-T载体上,并测序分析.结果表明,文昌鸡PRL基因与GenBank 上已公布的白来航、泰和丝羽乌骨鸡核苷酸序列同源性分别为93.3%和93.5%,而氨基酸序列同源性均为89.6%;与其...     

猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

采用比较基因组学和简并PCR方法,根据人、小鼠和大鼠等物种PLIN基因的序列,设计简并引物,克隆了猪PLIN基因包括起始密码子的部分cDNA序列,大小为978 bp(GenBank登录号为EU416277)。该序列与人和小鼠相应序列的相似性分别为87%和83%,编码325个氨基酸,具有1个PAT-1结构域、2个蛋白激酶A位点和1个富含谷氨酸的酸性基序,预测的氨基酸序列与人、小鼠、牛和绵羊相应区域序列的相似性分别为87%,82%,86%,86%。该基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

多年生黑麦草MYB转录因子基因的克隆及序列分析

为进一步研究MYB类基因在多年生黑麦草抗逆和发育中的功能,以多年生黑麦草为材料,采用同源克隆的方法对其抗逆和发育相关MYB转录因子的保守区进行PCR扩增和克隆,并进行了序列分析和功能预测。测序结果表明,获得了3个不同的MYB转录因子基因片段,分别命名为LpMYB1、LpMYB2和LpMYB3。LpMYB1和LpMYB2长度均为221bp,内含子为103bp,编码39个氨基酸;LpMYB3长度为202bp,内含子为84bp,编码39个氨基酸;同源比对结果表明,所得3个MYB基因可能参与多年生黑麦草对逆境的应答和植株的形态建成;进化树分析表明,3个MYB基因的系统发育符合单子叶植物的进化模式。由此可见,3个MYB基因参与了多年生黑麦草抗逆性和发育的表达,为进一步研究多年生黑麦草MYB转录因子基因的功能研究奠定基础。     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

蒙桑肌动蛋白基因的克隆与序列测定

为蒙桑基因表达与调控模式的研究以及蒙桑资源的利用提供参考,进行了蒙桑肌动蛋白(actin)基因的克隆与序列测定。结果表明:蒙桑actin基因mRNA序列大小为1 699bp,其中基因编码区1 134bp(GenBank登录号:KF031062),编码的377个氨基酸残基与其他植物的一致性在98%以上。该基因和川桑基因组中其他4个actin基因外显子数量和长度相同,但内含子差异极大,其CDS与桑树Morus010751(EXC30503)的一致性达到98%,氨基酸一致性为100%。聚类分析将其归为Class II类,与来自桑属和毛果杨的actin基因最先聚合在同一分支。     

蕙兰Actin基因的克隆及序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参.为研究其他基因的调控机制或外源基因在蕙兰中的相对表达提供内参,根据GenBank已经登录的肌动蛋白(Actin)基因的同源核苷酸保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR的方法,以蕙兰花蕾期的花葶为材料,克隆了4个Actin基因片段.序列分析结果表明,4个Actin基因片段长度均为1 062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的标记位点:肌动蛋白(YVGDEAQs.KRG和WISKaEYDE)和肌动蛋白类似物(LLTEApLNPkaNR).各片段之间同源性高达95.97％,经BLAST分析,与文心兰同源性可达94％.其氨基酸序列与萼脊兰(AED94091.1)和蝴蝶兰(AAF71265.1)同源性达99％.得到的4个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为CfACT1、CfACT2、CfACT3和CfACT5,并在GenBank注册,登录号分别为JN177718、JN177719、JN177720和JN177721.     

核桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

利用1对兼并引物,从核桃(Juglans regia)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为JrPAL.GenBank登录号为AY747676.JrPAL长866bp,编码289个氨基酸.通过核苷酸和蛋白质序列多重比较,发现JrPAL与其他植物的PAL基因高度同源.JrPAL编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性住点.PAL系统进化树表明,JrPAL与乔木类植物的PAL基因聚类关系最近.克隆JrPAL,可为利用基因工程技术调控核桃黄酮化合物的代谢提供基因资源.