辐射外源DNA导入小麦诱变效果的研究——后代品系籽粒贮藏蛋白分析和大麦黄矮病抗性鉴定

通过花粉管通道法将受照射的中 5DNA(小偃麦异源 8倍体 ,抗大麦黄矮病 )导入到受体小麦新克旱 9,在D3～D5 代获得了稳定的 5 4个品系。对其籽粒醇溶蛋白和麦谷蛋白进行电泳出现 3种变异类型 :第 1种类型为新谱带的出现或原有谱带的丢失 ;第 2种类型为供体谱带的出现 ;第 3种类型为谱带强度 (深或浅 )发生变化。根据农艺性状和籽粒贮藏蛋白电泳结果 ,精选 2 0份进行毒蚜接种 ,鉴定大麦黄矮病抗性 ,其中有 7个品系中抗黄矮病 ;1个品系 (97K1 0 77)高抗黄矮病。可初步认为供体中 5的抗大麦黄矮病基因已转化成功     

马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建

本研究报道马铃薯Ｙ病毒普通株系外壳蛋白基因ｃＤＮＡ克隆,全序列分析及其原核表达载体构建的结果。从感染ＰＶＹ的烟草叶片中提取病毒粒体,ＳＤＳ－酚法提取病毒核酸。以所提核酸为模板,用一对ＰＶＰＣＰ基因引物进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增了０．８０ｋｂ的特异性核苷酸片段。该片段大小五国外报道的ＰＶＹ ＣＰ基因一致,将ＰＤＲ产物插入到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中转化大肠杆菌ＤＨ５α。     

小麦黄色花叶病毒外壳蛋白基因E.coli表达产物特异性抗血清的制备及其应用

将小麦黄色花叶病毒（wheat yellow nosaic virus,WYMV)外壳蛋白克隆到pET-30a( )上,获得E.coli表达载体pETWCP。SDS－PAGE和Western blotting分析结果表明,pETWCP在E.coli中经IPTG诱导后,可特异地表达38．5kD的融合蛋白,光密度扫描分析结果,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的40％。以诱导表达产物作为抗原,免疫家兔制备了特异性强的抗血清,用微量沉淀法测其效价为1：1024。该抗血清可替代常规病毒粒子抗血清,用于酶联免疫吸附测定,免疫电镜Western blotting检测WYMV。     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒分离物外壳蛋白基因的克隆、原核表达及特异抗血清的制备

利用RT-PCR获得苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）库尔勒香梨分离物外壳蛋白（CP）基因。经序列分析表明，库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）分离物CP基因由582个核苷酸组成，编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质（GenBank accession No．AY669389）。将其克隆到表达载体pET-28a（＋）中，转化大肠杆菌（Eschedchia coli）BL21，筛选得到阳性克隆pET-ACP。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表明，预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达。回收原核表达的目的蛋白，免疫家兔，制备了ACLSV外壳蛋白的特异性抗血清。Western blot分析表明，所制备的抗血清可用于检测样品中的ACLSV。     

小麦蓝矮病植原体溶血素基因的分离及蛋白结构功能预测

从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出溶血素基因,大小为1 266 bp,编码421个氨基酸(GenBank登录号:EU747230).用生物信息学方法预测该蛋白在植原体侵染寄主过程中的致病作用.结果表明.该蛋白的二级结构中主要是螺旋,其次为折叠和无规则卷曲,不含转角,三级结构中含有三个功能区:DUF21(跨膜区结构域),CBS-pair-CorC-HlyC(双胱硫醚夂铣擅附峁褂和CorC-HlyC(转运体相关结构域).推测WBD的溶血素蛋白是具N端前导序列的N-末端跨膜蛋白,可能通过DUF21结构域中的跨膜螺旋与寄主细胞相互作用,由CBS结构域获得寄主的ATP,经CorC-Hlyc结构域转运,从而改变寄主体内ATP/ADP的浓度平衡而引发病害症状.     

水稻条纹病毒CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及原核表达

PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）外壳蛋白（coat protein，CP）基因。分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体，构建获得了融合基因PR-CP和PR-S-CP。测序鉴定融合基因构建正确后，将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE电泳和Western blot对表达产物进行了鉴定。结果发现，融合基因表达产物大小与预期结果一致，且能与RSV CP抗体特异结合。说明融合基因中的RSV CP获得了正确表达，在融合蛋白中保持了自身独立的抗原活性，推断融合基因在生物体内的表达可能都能保持每个蛋白各自独立的结构和功能。     

苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因在白三叶中的表达及转基因植株的抗病性分析

以白三叶(Trifolium repens L.)的两个品种Irrigation和Huia的子叶为转化体，用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源的苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入白三叶，经过筛选、分化和再生，得到了具有卡拉霉素抗性的再生植株。对这些植株进行PCR、Southern和Northern分析，结果表明，外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。对Northern分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，证明表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了免疫的程度。     

Evaluation of Chinese Triticeae for resistance to Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV)

Summary Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) is recognised as a major pathological constraint to cereal production in northern China and several widespread epidemics have been reported. The host range of BYDV includes not only cereals but many grasses. The indigenous Triticeae of northern China have likely been exposed to significant disease pressure from BYDV and therefore may be a potential source of BYDV resistance for cereal improvement. A wide range of Triticeae accessions collected over three expeditions in northern China were evaluated for resistance to BYDV. Seedlings were artificially inoculated and virus levels then assayed by ELISA. Resistance and immunity to BYDV were found to be widely distributed among the seven genera of Triticeae included in the screening. A high proportion of resistant and immune accessions was found in the genera Hordeum, Leymus, Elymus and Elytrigia. The wide range of reaction types to BYDV found within many species, and even between accessions of some species, indicates that natural selection for BYDV resistance may have been relatively recent in the Chinese Triticeae. A high proportion of resistance and/or immunity was found in Xinjiang compared to the general distribution. From the Chinese Triticeae tested the Leymus species may be the most appropriate material to initiate transfer of BYDV resistance to wheat.     

25份小黑麦品种(系)的抗黄矮病鉴定与评价

2015年采用田间人工接种法,对25份小黑麦品种(系)进行了由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)引起的小黑麦黄矮病的田间抗性鉴定和评价。结果表明,在供试的25份小黑麦品种(系)中未检测出免疫、高抗和抗病材料。有4份材料(农41、1519、1529和41)表现为中抗(MR),占供试材料的16.00%;12份材料表现为感病(S),占供试材料的48.00%;9份材料表现高感(HS),占供试材料的36.00%。将25份小黑麦品种(系)进行聚类分析,可划分为3类,从谱系图上可以看出,抗病性相同的品种(系)大致划分在同一个类中。     

多选择标记植物表达载体的构建

具有多选择标记的植物基因表达载体有利于转基因植物研究中的转基因植株的筛选。本研究对植物基因表达载体pCAMBIA1301进行了改造,产生了1个具有可溶性的红移绿色荧光蛋白基因（smRS-GFP）、抗除草剂Basta、葡萄糖苷酸酶（GUS）及潮霉素（Hpt）的多选择标记的新的植物基因表达载体。运用这一表达载体的多选择标记可以有效降低检测和筛选转化植株时的假阳性率。此外,如此的基因表达载体也能满足实验室的不同筛选方法的需求。     

与南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10互作的寄主因子筛选

为找到水稻中与南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)外壳蛋白P10(CP)相互作用的寄主蛋白,利用P10筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库,寻找水稻中与P10互作的蛋白并结合生物信息学技术进行分析,回转验证.结果表明,筛选到10个可能与P10互作的水稻寄主蛋白,如胚发育晚期丰富蛋白Lea14-A、硫氧还原蛋白TRXh1、...     

PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及其在雪柑转基因中的应用

以大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因以及pBI121中的gus基因,构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301PMI和pBIPMI,并导人根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中.研究了两种表达载体对雪柑(Citrus sinensis L.Osbeck)上胚轴的转化,在培养基附加25 g/L甘露糖和5 g/L蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1301PMI的转化率为27.7%,pBIPMI转化率为12.7%,对再生植株用氯酚红和PCR检测证实了PMI基因的导入,建立了以PMI/甘露糖为选择系统的雪柑转基因体系.     

草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因的克隆及其反义表达载体的构建

在已报道的FaEtr1和FaErs1基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓(Fragaria ananassa)乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列和FaErs1基因445bp部分特异序列,将上述2个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1和pBI121Ers1。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA1301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。将这3个重组表达质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1和pFRS导入根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

低温诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及小麦转化

选择标记基因的剔除是转基因植物商品化种植的重要基础.为建立小麦(Triticum aestivum)低温诱导的位点特异性标记基因删除体系,本研究以小麦西农928基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得小麦低温诱导表达wcs120启动子,序列分析表明,该序列与GenBank中序列AF031235相比有一段21 bp插入,与AY493570.1序列完全一致.以含有CinH/RS2单向位点特异性重组系统的植物表达载体pXL5513为框架,成功构建了包含有抗旱相关性基因PYL5(pyrabactin-resistance like gene 5)表达框的低温诱导的位点特异性重组植物表达载体pXL5513-fwcs-RDA;并对小麦绵阳19(M19)幼胚愈伤组织进行基因枪转化,1 745块愈伤组织经筛选分化共获得9株转基因植株,经PYL5基因特异引物PCR检测,6株为阳性植株,低温春化处理后经删除引物PCR检测,6株阳性植株初步证实成功删除了选择标记基因.本研究为利用低温诱导的位点特异性重组系统进行小麦无标记基因转化奠定了基础.     

拟南芥中与植物生长和耐寒相关的miRNA表达载体的构建

本研究通过PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了3个理论推断与耐寒相关的miRNA片段（miRNA402,miRNA319和miRNA393）和1个与植物生长相关的片段miRNA172。利用重叠延伸PCR技术将miRNA172小分子,以及3个与耐寒相关的miRNA402,miRNA319和miRNA393小分子串连在一起分别导入植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA,取代表达载体中的GUS基因,构建了pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir31＋402＋393-pA融合表达载体。经PCR和双酶切及测序鉴定,pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir319＋402＋393-pA构建成功,为后续利用基因工程手段,miRNA转化木薯,提高木薯生长和木薯耐寒相关研究奠定基础。     

花生条纹病毒外壳蛋白基因cDNA的合成、克隆及全序列测定

自田间采集的花生病叶中提取花生条纺病毒（ＰＳｔＶ）总ＲＮＡ,人工合成引物Ｐ１、Ｐ２,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成ＰＳｔＶ－ｃｐ的ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定,结果表明：该布１０８４个核苷酸组成,包含了ＰＳｔＶ－ｃｐ ｃＤＮＡ完整的８６１ｂｐ编码序列（编码２８７个氮基酸）以及３＇端２２３ｂｐ非编码序列,与文献报道的４个ＰＳｔＶ－ｃｐ基因具有较高的保守性。