溶菌酶活力测定方法的改进

本文以壳聚糖代替溶壁微球菌作底物测定溶菌酶的活力。实验证明:在55℃,pH=4.5时,达到最大酶反应速度。酶浓度在0～4.5U/ml范围内符合郎伯-比尔定律,回归方程为Y=0.2173X-0.0114,线性相关系数为γ=0.9998。     

Enzymatic Synthesis and Structural Confirmation of Novel Oligosaccharide,D-Fructofuranose-linked Chitin Oligosaccharide

Utilizing transglycosylation reaction catalyzed by β- N -acetylhexosaminidase of Stenotrophomonas maltophilia , β-D-fructofuranosyl-(2↔1)-α- N , N ´diacetylchitobioside (GlcNAc ₂ -Fru) was synthesized from N -acetylsucrosamine and N , N ´-diacetylchitobiose (GlcNAc ₂ ), and β-D-fructofuranosyl-(2↔1)-α- N , N ´, N ´´-triacetylchitotrioside (GlcNAc ₃ -Fru) was synthesized from GlcNAc ₂ -Fru and GlcNAc ₂ . Through purification by charcoal column chromatography, pure GlcNAc ₂ -Fru and GlcNAc ₃ -Fru were obtained in molar yields of 33.0 % and 11.7 % from GlcNAc ₂ , respectively. The structures of these oligosaccharides were confirmed by comparing instrumental analysis data of fragments obtained by enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis of them with known data of these fragments.     

低分子量壳聚糖制备与应用

该文介绍自然界蕴藏量极为丰富绿色生物材料甲壳素脱乙酰化产物-壳聚糖降解产物壳低聚糖的制备、功能性、应用及发展前景。     

微生物酶法合成低聚糖的问题与策略

主要讨论利用微生物酶法合成低聚糖所存在的相关问题及其策略,涉及酶法合成低聚糖的酶源、底物特异性、副反应以及工艺技术等,旨在促进相关研究以增加酶法合成低聚糖的品种、提高底物转化率和产品规格。     

表面脱乙酰化甲壳素颗粒固定溶菌酶及酶学性质研究

本研究以表面脱乙酰化甲壳素颗粒为载体,以戊二醛为交联剂,对溶菌酶进行固定化。本文利用正交试验设计,以蛋白利用率、活力回收率和保藏稳定性为指标,以半脱乙酰壳聚糖为底物,3-甲基-2-苯丙噻唑啉酮腙(MBTH)法为酶活力测定方法,优化了关键固定化参数,并考察了固定化对溶菌酶酶学性质的影响。结果表明:固定化过程中最佳脱乙酰时间(A)为25 min,戊二醛浓度(B)为5%,载体活化pH(C)为5.0,在此条件下固定化的溶菌酶与游离溶菌酶相比,其表观最适pH由4.0降至3.5;最适温度由75 ℃升高至80 ℃,且在70~90 ℃仍保持95%活力;K_m为2.69 mg/mL,明显大于游离酶的1.75 mg/mL;15 d稳定性保持66%。因此,固定化提高了溶菌酶的热稳定性和贮藏稳定性,具有广泛的应用前景。     

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

基于生物信息学与分子对接技术对坛紫菜降血压肽的筛选及活性分析

采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶双酶联合水解坛紫菜蛋白（Porphyra haitanensis protein,PHP）制备降血压活性肽,测定了经超滤后各个分子质量PHP酶解液清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）阳离子自由基能力、铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）以及血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性。经质谱鉴定和活性肽数据库BIOPEP以及AHTPDB网站查找筛选活性肽,采用分子对接解释多肽抑制ACE机理,并对双酶酶解PHP动力学进行研究。结果表明：经超滤后的8?个分子质量的坛紫菜多肽组分中,＜0.5?kDa的组分具有最高DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,＜1?kDa的组分具有最高FRAP值,而0.5～1?kDa组分IC50值（（2.21±0.28）mg/mL）最低。经查找筛选出14?条降血压肽,其中4?条肽的序列和对接能量分别为AVP（－5.87?kJ/mol）、GPL（－6.13?kJ/mol）、LDY（－7.65?kJ/mol）和LGYL（－7.78?kJ/mol）。酶解动力学模型预测PHP水解度与实验水解度相对误差在10%以下。本实验基于串联质谱与分子对接技术,通过生物信息筛选和体外活性检测从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽,探究多肽抑制ACE的机理,并建立了描述蛋白可控酶解过程规律的动力学模型,为活性肽的制备提供了参考和借鉴。     

AB-8大孔树脂固定化溶菌酶及酶学性质研究

利用AB-8大孔树脂为载体,戊二醛为交联剂对溶菌酶进行固定化,研究固定化酶的制备条件、酶学性质、微观结构及抑菌效果。结果表明：固定化时间4h、固定化温度25℃、戊二醛质量浓度0.3g/100mL、m酶:m载体＝1:200时固定化溶菌酶的相对酶活力最高;与游离酶相比,溶菌酶经过固定化后耐热性提高、耐酸性增强,米氏方程分析表明,溶菌酶经过固定化后与底物壳聚糖的亲和力下降,固定化酶重复使用5次时,酶活力残留率为57.6%,抑菌实验结果表明,固定化溶菌酶对纯牛奶具有较好的抑菌效果。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

Lysozyme in Wine: An Overview of Current and Future Applications

Lysozyme, a muramidase enzyme from egg whites (EC 3.2.1.17), is widely used in soluble form to control lactic acid bacteria in different foods. Moreover, hen egg white lysozyme is a hydrolytic enzyme that can be used to the control malolactic fermentation (MLF) during winemaking. MLF is only desirable in red and in some white wine, this suggest that MLF is at fault and needs to be controlled in all other types of wine. Lysozyme exhibits selective antimicrobial activity based on the hydrolysis of peptidoglycan cell wall constituents in lactic acid bacteria. In the last decade, several studies identified allergic reactions due to the presence of lysozyme in food. Given this relatively high incidence of lysozyme sensitization, and in accordance with the recently changed EC food legislation (1266/2010/CE), the use of lysozyme as an additive has to be declared on the ingredient label. To overcome this problem, the immobilization of the enzyme on insoluble supports, which allows the enzyme to be removed, has been the preferred strategy. In this context, this article offers a review of reports on lysozyme enological use over the last decade. It surveys the immobilization techniques and support materials used for lysozyme food preservation. This study attempts to provide useful guidance from the wealth of available immobilization data in the literature and, more importantly, to develop an integrated perspective on how to customize lysozyme for future enological uses.     

重组脂肪氧合酶基因工程菌破碎条件优化及其酶活力测定方法研究

建立适用于从重组E.coli中提取重组脂肪氧合酶非机械法的破碎条件。采用化学渗透法、冻融法和酶解法破碎重组E.coli细胞,并采用单因素试验和L25(56)正交试验对细胞破碎条件进行优化。结果表明:溶菌酶添加量为1.5mg/mL、溶菌酶处理时间40min、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)添加量为2.0mmol/L、吐温-60添加量为2%、冻融温度(-70℃冷冻37℃融解)、冻融次数3次,效果最佳,获得粗酶液的脂肪氧合酶(LOX)酶活力为6840U/mL,比优化前(4750U/mL)提高了0.44倍;并在此条件下,比较分光光度法、碘化钾-淀粉法和二甲苯酚橙法测定LOX酶活力,其中碘化钾-淀粉法简单、灵敏、快速,且测定体系具备肉眼可辨的特征颜色,可用于LOX酶活性高通量筛选。     

月桂酸衍生物的合成与抑菌性的比较研究

本文进行了月桂酸衍生物(月桂酸单甘酯GML、月桂酸双甘酯和三甘酯GDL+GTL、聚甘油月桂酸单甘酯PGML)合成的研究,并比较了其抑菌活性和皮肤致敏性,以获得应用性能更佳的月桂酸产品。采用固体酸性盐催化的酯化反应合成月桂酸衍生物,优化的反应条件为:催化剂NaHSO4用量为月桂酸重的0.3%,底物摩尔比为1:2,温度200℃、真空条件下反应5h;反应产物采用分子蒸馏提纯,得到的月桂酸单甘酯和聚甘油月桂酸单甘酯纯度较高。采用平板菌落计数法测定月桂酸衍生物的最低抑菌浓度,结果表明:月桂酸、GML和PGML对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较好的抑菌活性,但在相同条件下月桂酸和GML的抑菌效果要优于PGML,GDL+GTL则无抑菌活性。通过皮肤致敏性测试,证实月桂酸衍生物均不会导致人体皮肤过敏。     

甲壳素的酶水解机理及动力学研究进展

甲壳素和壳聚糖不仅可被甲壳素酶、壳聚糖酶和溶菌酶水解 ,还可以被一些包括蛋白酶、脂肪酶和其它糖酶的非专一性酶水解 ,这些酶对甲壳素和壳聚糖解聚的作用机理和动力学 ,对于开发甲壳素和壳聚糖在食品、化工、医药、农业等领域中的应用具有重要意义 .为此 ,介绍了近年来国外的研究进展 .     

重组海参溶菌酶N端可溶性表达与抑菌分析

通过对海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)cDNA(Genbank accession no:EF036468)片段的分析,结果发现N端基因区域所对应的蛋白质序列中含有糖苷酶活性。因此利用RT-PCR技术以其为模板,扩增出长度为174 bp的溶菌酶N端(SjLys-N)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-N,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组SjLys-N的基因工程菌。该工程菌在改造的LB培养基和最适的发酵条件下经IPTG诱导后,表达约23 kD的重组SjLys-N蛋白。此外,它还能以可溶性的形式表达,占总菌体蛋白约46%。经过Western blotting分析,重组SjLys-N在23 kD左右能够与penta-his抗体发生特异性免疫反应,结果表明重组SjLys-N得到正确的表达。最后对纯化后的重组SjLys-N进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌和副溶血弧菌有较高的抑菌活性。上述结果将为进一步研究海参溶菌酶的基因结构与功能之间的关系提高参考。     

壳聚糖、溶菌酶和牛至油对大豆分离蛋白膜抑菌效果的影响

采用双倍稀释法研究壳聚糖、溶菌酶和牛至油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。采用抑菌圈法研究添加天然抑菌剂壳聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分离蛋白膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉的抑菌效果。结果表明,添加壳聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分离蛋白膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉均有抑制作用。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果为:牛至油>壳聚糖>溶菌酶。对酿酒酵母的抑制效果为:壳聚糖>牛至油>溶菌酶;对黑曲霉的抑制效果为:牛至油>壳聚糖>溶菌酶。因此,添加壳聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分离蛋白膜具有较好的抑菌效果和应用前景。     

固定化酶催化抗坏血酸硬脂酸酯的合成及抗氧化活性

研究液体脂肪酶CALB的固定化及其催化抗坏血酸和硬脂酸的酯化反应合成抗坏血酸硬脂酸酯（AS）。以大孔吸附树脂为固定化载体,对液体脂肪酶CALB进行固定,固定化负载率可达72%。探讨不同反应变量（反应溶剂、温度、酶添加量、底物物质的量比、底物浓度和分子筛添加量）对酯化反应的影响,并对反应条件进行优化,优化的反应条件为：反应温度72℃,底物物质的量比1∶12,酶添加量22.49%（质量分数）,反应24 h,在此优化条件下,AS产率可达（41.33±1.81）%。对产品进行分离纯化,并采用质谱等检测确定产品为AS。通过Rancimat实验发现AS具有良好的抗氧化性,添加100 mg/kg AS的玉米油氧化诱导期与添加50 mg/kg TBHQ的玉米油氧化诱导期接近。     

超高压和热处理对果蔬中 四种香气合成酶活性与结构的影响

以果蔬香气代谢过程中四种关键纯酶为原料,研究超高压和热处理对酶活性、结构及其之间相关性的影响。结果表明,脂氧合酶(LOX)、磷脂酶A2(PLA2)、酰基转移酶(AAT)活性经过不同热处理和高压处理后呈降低趋势,乙醇脱氢酶(ADH)呈上升趋势;通过SDS-PAGE电泳发现四种酶的一级结构没有发生变化,二级和三级结构均发生不同变化。LOX经过超高压处理后,α-螺旋含量降低,β-折叠含量明显增加,荧光强度均比空白组高;ADH的二级结构变化中主要是无规则卷曲增加明显,荧光强度均比空白组低。在两类处理中均发现LOX活性与α-螺旋,PLA2与荧光强度显著相关。     

产几丁质降解酶菌株的筛选及其产酶条件

采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质降解酶菌株L12酶活力为0．63U／mL。通过产酶条件优化，初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。条件优化后酶活力提高约1．6倍，达到1．06U／mL。     

无溶剂体系酶促合成甘油中碳酸偏酯

根据中碳酸转化率的大小 ,对 5种不同来源的固定化脂肪酶筛选 ,其中固定化脂肪酶SSW的酶催化转化率最高 ,辛酸和癸酸转化率分别为 91.5 %和 93.5 % ;对脂肪酶SSW酶促合成甘油辛酸偏酯的反应条件优化 ,适宜反应条件为 :敞口反应器中反应温度 5 5℃ ,每克酸加酶量 10 0U/g ,辛酸 /甘油投料摩尔比 1∶1.1,甘油初始加水量 4 % (质量分数 ) .实验范围内中碳酸品种对脂肪酶SSW不显示基质特异性 .     

国产垦啤-2号大麦制麦酶系的影响因素

以垦啤 2号大麦(适合东北气候、土质种植)为原料,将酶活分析方法与传统制麦方法相结合,按照最佳制麦工艺所得成品麦芽各项指标均介于一级品与优级品之间,其中,糖化力、糖化时间、α 氨基氮、可溶性氮均优于优级品.通过研究制麦过程中各种添加剂对绿麦芽酶活的影响表明,利用体积分数0.1%甲醛浸麦1h效果较好;同样条件下,较质量分数0.9%NaOH浸麦,制麦酶系都有所提高.