球孢白僵菌几丁质酶基因chitl真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chitl,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

PEG-CaCl_2介导苏云金杆菌CryⅠA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaC l2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryⅠA(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2~3个转化子/μg质粒DNA.Southern b lot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠA(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌CryIA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的Cry Ⅰ A(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2～3个转化子/μg质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠ A(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及在酵母中的表达

本实验从构建于大肠杆菌DH5α的瑞氏木霉cDNA文库中用PCR法体外扩增到木聚糖酶I（XynI)的DNA片段，然后连接至穿梭载体pAJ401,转化酵母H158,以刚果红染色法筛选阳性重组子并测序，当将其mRNA5‘端非翻译区的79个碱基删除后，木聚糖酶的表达水平显著提高，有可能此基因的调节区位于5‘端非翻译区内，而且可能被酵母的相关基因表达因子所识别。     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

响应面法优化重组毕赤酵母表达纤维素酶EG27的研究

为优化重组毕赤酵母表达动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件,在单因素实验基础上,以培养基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量为自变量,EG27的酶活为响应值,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对毕赤酵母产EG27收率的影响。利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对毕赤酵母产动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件进行优化,确定了最佳的培养基条件。在该培养条件下,获得最高产酶量为354U/L。     

秸秆降解菌株的诱变选育及发酵条件的研究

为提高纤维素酶活性,获得降解秸秆能力强的菌株,采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法处理绿色木霉(Trichoderma viride)菌株,通过刚果红培养基初筛并进行10代PDA斜面继代培养和液体发酵复筛,选择纤维素酶活性高的菌株,以秸秆为底物进行液体发酵条件优化.结果表明:选育出6株稳定高产纤维素酶的绿色木霉(T.vi...     

纤维素降解菌绿色木霉C-08产酶条件研究

为了确定绿色木霉C-08菌株的最佳产酶条件,对从土壤中筛选到一株具有较高纤维素酶活性的绿色木霉的液态发酵条件进行了优化,结果表明,麸皮和稻草作为最佳碳源可较大幅度地提高纤维素酶的产量,C-08的最佳麸皮和稻草质量比为5∶2.C-08株菌的最佳无机、有机氮源为(NH4)2SO4和豆饼粉,最佳无机、有机氮源比为1∶5.最适宜的碳氮比为5∶1,质量分数为3.6%.产酶的最适宜温度为30℃,最佳产酶pH为3.2,最佳产酶时间为96h.     

FGFR3胞外区在酵母中的表达

对酵母中FGFR3胞外区蛋白表达进行研究.从pCDNA3.1-myc-His-FGFR3N中酶切得到带有myc/His标签的FGFR3胞外区DNA片段,将其克隆到pYES2中;采用醋酸锂转化法,将重组质粒转入酵母INVSc1;转化子经半乳糖诱导后,提取总蛋白进行Western-blot分析.测序结果表明:pYES2-myc-His-FGFR3N载体构建成功,Western-blot分析证实重组转化子在酵母中表达了与预期分子量大小吻合的FGFR3胞外区蛋白.     

稻秆纤维素降解菌的分离筛选和降解性能研究

从种稻红壤中分离微生物菌株,经紫外诱变后得到了3株高效的稻秆纤维素降解菌株,分别为细菌YB20、真菌F9和YF15.经鉴定,菌株YB20为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.),菌株F9和YF15均为绿色木霉(Trichoderma viride sp.).对3株纤维素降解菌株产酶特性进行了初步研究...     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌生产纤维素酶EGA的研究

通过响应面优化法（response surface methodology,RSM）对分泌表达纤维素酶EGA重组枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化。利用Plackett-Burman实验设计对淀粉、酵母粉、蛋白胨等8个因素对枯草芽孢杆菌产纤维素酶EGA的显著影响与否进行评估分析,筛选得到淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O为3个显著影响的因素,再利用Box-Behnken实验设计对这3个因素进行进一步优化,确定最佳培养基的配比为淀粉21g/L,酵母粉11.26g/L,蛋白胨25g/L,MgSO4·7H2O 1.52g/L,KH2PO40.395g/L,NaCl 3.25g/L,CaCl20.1g/L,FeSO4·7H2O 0.005g/L。在最优条件下,利用小型发酵罐对重组菌进行扩大培养,其最高酶活力达到1 264U/L。     

Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of chit2 gene from Beauveria bassiana

To study recycled trashes from shrimps and crabs in the sea through chitinase secreted by microorganisms,the chitinase gene chit2 was cloned and sequenced from Beauveria bassiana by the polymerase chain reaction(PCR),and was ligated into the yeast expression vector pYES2.The expression vector plasmid was transformed into Saccharomyces cerevisiae H158.Gene expression took place upon induction with 2% galactose.The measurement of enzyme activity shows that the expression production can be expressed in active forms and secreted to the medium.The enzyme activity approaches the peak of 0.63 U/mL when the culture time is 36 h.     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化的研究

本实验用培养基透明圈法从7种芽孢杆菌中筛选到酶活最高的三株芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌4.37、高龙枯草芽孢杆菌w-031 3.83、地衣芽孢杆菌3.83)。用测定发酵液酶活的方法进行菌株的复筛,酶活最高的菌株为枯草芽孢杆菌。对该菌产酶条件进行了单因素实验发酵条件的优化,最优产酶条件为:最佳碳源是魔芋粉,含量为4%,最佳有机氮源为酵母浸粉,最佳无机氮源为硝酸钠,最佳产酶时间为36 h。