真核RNA聚合酶

真核细胞含有3类核RNA聚合酶和线粒体RNA聚合酶,植物细胞另外含有叶绿体RNA聚合酶,它们总共约由近30种不同亚基组成,其中有许多亚基的基因已经克隆、定位和序列分析,本文简述这些酶及其亚基的结构、功能和基本性质以及在RNA合成中的作用与研究现状。     

DNA聚合酶

DNA聚合酶可以催化四种不同的脱氧核苷三磷酸合成DNA。最初由Kornberg(1956)等首先从大肠杆茵提取液中发现,被命名为DNA聚合酶Ⅰ(又称Kornberg酶)。此后,又陆续发现了大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ。根据DNA聚合酶提取的来源不同,可分为原核细胞DNA聚合酶和真核细胞DNA     

在哺乳动物细胞中用于表达干扰RNA的启动子

RNA干扰是由双链RNA诱导的特异性转录后基因表达沉默。目前用于在哺乳动物细胞中表达干扰RNA的启动子分为RNA聚合酶Ⅲ类启动子(polⅢ)及RNA聚合酶Ⅱ类启动子(polⅡ)。不同的启动子及经过不同方法改造后的启动子能满足不同研究目的的需要,从而极大地拓展了RNA干扰的应用范围。     

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ与基因表达和基因治疗

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ (polⅢ )能催化 5SrRNA、tRNA、U6SnRNA等一些小的、稳定的RNA的合成。文章综述了依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录复合物 ,并介绍了RNA聚合酶Ⅲ的转录在基因表达和基因治疗 (核酶、反义核酸、RNA干扰技术等 )研究中的应用价值。     

脊髓灰质炎病毒的多尿苷酸聚合酶和RNA复制酶具有同样的病毒多肽

脊髓灰质炎病毒的基因组是单链RNA,在感染的细胞质内借助于依赖RNA的RNA聚合酶(复制酶)进行复制。这种复制酶可能会有一种或多种病毒编码的蛋白质,但证据还不充分。作者曾分离到一种可溶性的脊髓灰质炎病毒特异的依赖RNA的RNA聚合酶,多尿苷酸聚合酶,     

反意RNA对基因表达调控作用的研究进展

某一特定基因表达有活性的蛋白质,要受到许多因素如转录、转录后修饰及翻译等诸多环节上的调节,这些都是众所共知的。近年来,反意RNA(antisense RNA)对基因表达的调控作用日益受到人们的重视。反意RNA是指核苷酸顺序与其所调控基因的RNA顺序互补的RNA片段,它是此基因的非编码链或称无义链(nonseuse strand)的转录产物。它可以通过配对碱基间氢键的作用,与对应的RNA形成双链复合物而影响RNA的正常修饰、翻译等过程,从而起到调控作用。从目前已发表的对原核细胞系统和真核细胞系统的研究资料看,反意     

探索小RNA的功能

基因表达的调控———决定于细胞内产生多少何种的蛋白质———是由无数不同的分子控制的.一种自然产生的调控分子是小的干扰RNA(siR NA) ,它选择性地中断按计划已认可的蛋白质的产生,这个过程称为RNA干扰.这些短的核苷酸延伸结合与其它细胞的蛋白质形成了一种RNA诱导的静止复合物,称为RISC ,它能定位并且破坏一种靶信使RNA—这种分子是把某种蛋白质的信息,从细胞核携带到它生成的细胞质位置.生物学家们在动植物中发现了几百种其它自然产生的短小调控RNA ,称为miRNAs .像siR NA ,他们也能通过类似的甚至可能是相同的RISC分子影…     

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的研究进展

真核生物的基因表达是一个复杂的过程,参与转录的RNA聚合酶和一些因子起主要作用.在真核生物的3种RNA聚合酶中,又以RNA聚合酶Ⅱ的作用最大,它负责转录生成hnRNA和mRNA,对生物的多样性及生命的存在均有重要的意义.     

核糖核酸酶Ⅲ对脊髓灰质炎病毒Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ型RNA的限制性切割

本文作者进行了大肠杆菌的核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)切割脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基因组核糖核酸(RNA)的研究。结果表明三种脊灰病毒基因组RNA能被RNaseⅢ切割成独特的片段。作者以不同的NH_4Cl浓度条件下,及恒定量的     

血管紧张素在培养乳鼠心肌细胞肥大发生中的作用

本实验观察到血管紧张素Ⅰ、Ⅱ(AngⅠ、AngⅡ)均可促进培养的乳鼠心肌细胞(MC)DNA、RNA和蛋白质的合成。并发现随着AngⅠ和AngⅡ作用时间的延长,对MC的RNA和蛋白质合成的促进作用也逐渐增强,而对其DNA合成的促进作用则有一定的时间界限。此外,还发现在AngⅠ和AngⅡ长期作用下可使MC体积增大。当AngⅠ和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂同时加入培养基,则无上述结果发生。这提示血管紧张素可能在心肌肥大的发生中起一定作用,而且AngⅠ是通过MC本身的ACE将其转化为AngⅡ后才起作用的。     

双向启动子小干扰RNA载体干扰效率的验证

RNA干扰技术是目前抑制基因功能较为有效的热点技术。通常用于表达小干扰RNA(siRNA)的载体多利用单个RNA聚合酶Ⅲ启动子转录连接在一起的2条互补回文序列,形成袢状结构的siRNA分子。这种方法需要较长的引物而造价较高,且容易错配,难于合成和测序;此外,袢的长度及序列的差异可以影响siRNA抑制基因表达的效率[1]。一种新型的siRNA表达载体逐渐获得人们的重视。这种载体利用2个RNA聚合酶Ⅲ,从目的序列的两端同时进行互为反向的转录,形成有功能的siRNA[2]。为了正确评价这种载体所表达的siRNA抑制基因功能的效率,我们构建了表达针对…     

Ser176/180磷酸化位点突变的IKKα真核表达载体的构建及鉴定

目的构建Ser176/180磷酸化位点突变的核因子κB抑制剂激酶α(IKKα)真核表达载体。方法通过PCR获得带有IKKαSer176/180突变位点和无义突变KpnⅠ位点的片段,以及带有无义突变KpnⅠ位点的片段,两片段分别经过HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoRⅠ双酶切,载体pEGFP经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后连接。共聚焦显微镜技术观察激活型/死型p EGFPIKKαKA/KD融合蛋白在真核细胞中的定位及其对P65核质易位的影响。Western blot法检测重组蛋白表达。结果测序显示载体构建成功。pEGFP-IKKαKA分布在细胞核和细胞质,并能使P65发生核穿梭。pEGFP-IKKαKD主要分布在细胞质,不能使P65发生核质易位。Western blot结果显示出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建IKKα磷酸化位点激活型及死型的真核表达载体,在真核细胞中可有效表达。pEGFP-IKKαKA/KD在真核细胞中蛋白表达呈现不同定位,对下游P65的核质穿梭调控发挥不同效应。     

酵母三杂交系统:一种在真核细胞水平研究RNA-蛋白质相互作用的有效方法

RNA-蛋白质之间的相互作用是真核细胞RNA在细胞内执行其功能的基础,这种相互作用在基因表达的多个水平上均发挥着重要的调控作用。要研究RNA对基因表达的调控就必须对RNA-蛋白质之间相互作用的方式进行研究。本文介绍的酵母三杂交系统(yeast three-hybrid system)是一种近年来在酵母双杂交系统的基础上发展而来的,可用于鉴定先前未知的,在自然界中存在且具有生物学意义的RNA-蛋白质相互作用的实验方法。该方法提供了一个在真核细胞内研究RNA-蛋白质相互作用的技术平台。它可以根据酵母细胞所表现出的简单表型及易于辨别的酶反应,对体内复杂环境中发生的RNA-蛋白质的相互作用进行遗传学分析。     

用单克隆抗体作探针研究大肠杆菌RNA多聚酶α亚基的排布(文摘)

本文用3株抗大肠杆菌RNA多聚酶α亚基的单克隆抗体(McAb 124D1,126 C6,129C4)研究了大肠杆菌RNA多聚酶α亚基性质。采用~(125)I标记McAb双抗体夹心检测与RNA聚合酶的结合能力。研究发现:3株单克隆抗体都不能抑制d(A-T)n引导的r(A-U)n合成;McAb 129 C4和McAb 126 C6株可以抑制RNA多聚核心酶体外重新构建,McAb 124 D1株则无作用;     

基因表达的调控

1951年Watson和Crick提出的模型指出遗传信息(基因)储存于DNA中,当基因被表达时,DNA首先转录成互补于一条DNA链的mRNA,再按三个核苷酸为一组的密码子译码为蛋白质。现在我们不谈染色体中编码蛋白质的DNA顺序,而讨论不编码蛋白质的那些DNA顺序,它们表现为具有调控功能的DNA,在基因表达中起调控作用。细菌基因表达的简单模型在细菌细胞中,DNA由RNA聚合酶转录成RNA,当RNA仍联在RNA聚合酶上时,核糖体就结合上去,蛋白质也就合成     

四膜虫RNA自身拼接与底物鸟苷间特异性相互作用——提示RNA具有生物催化作用

酶是能加快反应速率的生物催化剂,已知酶都是蛋白质。但是,某些酶的催化活性需RNA参与,如核糖核酸酶P、1,4-α糖原分支酶,土豆间二苯酚氧化酶等;核糖体肽酰转移酶则需RNA-蛋白质复合物。作者采用化学反应的动力学方法,研究了嗜热四膜虫的前RNA成熟转变为RNA的过程。作者发现该原虫的前RNA分子在体外能自发切除插入顺序,不需要蛋白质。但需要底物鸟苷。切除插入顺序后的RNA恢复成环形分子。前RNA的这种裂解-连接活性与单价、二价阳离子及鸟苷底物有关,鸟苷连接在插入序列的5’末端。作者还测定了反应的Km值,并用鸟苷类似物进行了竞争抑制试     

真核生物RNA聚合酶II的研究进展

真核生物的基因表达是一个复杂的过程,参与转录的RNA聚合酶和一些因子起主要作用。在真核生物的3种RNA聚合酶中,又以RNA聚合酶II的作用最大,它负责转录生成hnRNA和mRNA,对生物的多样性及生命的存在均有重要的意义。     

地高辛精标记大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精标记的大鼠代谢型谷氨酸受体第 5亚型 c RNA探针 ,本实验用分子生物学技术重组质粒 p GEMm Glu R5 ,经限制性内切酶酶切分析 ,证实其确有 m Glu R5基因片段插入且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化得到线性DNA片段 ,用 T7RNA聚合酶体外转录合成带有地高辛精标记的高比活性的单链 RNA探针 ;经斑点杂交实验证实该探针具有较高的敏感性和可靠性 ,可用于代谢型谷氨酸受体第 5亚型有关的研究     

一种双链RNA依赖的蛋白激酶突变体引发恶性转化

双链RNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-PK)是干扰素(IFNs)抗病毒和抗增殖作用的关键调节成分。dsRNA-PK为丝氨酸-苏氨酸特异的蛋白激酶,具有自身磷酸化和使真核细胞翻译起始因子eIF-2α亚单位磷酸化而引起蛋白合成抑制的作用。为探讨其     

牛痘病毒作为哺乳动物细胞的表达载体

T7等噬菌体的RNA聚合酶是原核类表达载体的基础,因真核mRNA在结构,转录及加工上与原核不同,所以很难将该酶用于真核细胞。将T7RNA聚合酶基因整合到牛痘病毒基因组中(可在细胞质中复制的DNA病毒),就不需在核中合成再转运的过程。在重组病毒vTF7-3中,该酶在牛痘病毒P7.5启动子的控制下,可将T7启动子控