胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA克隆

目的：分离克隆测序胃癌高表达基因ｇｃｙｓ－１８的部分ｃＤＮＡ．方法：采用ｍＲＮＡ差异展示技术从胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ－１细胞株中分离出一差异表达基因片段,对其命名,并进行克隆、测序及ＧｅｎＢａｎｋ检索;以此片段作探针与细胞株总ＲＮＡ进行打点杂交．结果：从差示ＰＣＲ电泳凝胶中分离出大小为４１６ｂｐ的差异表达片段,命名为ｇｃｙｓ－１８;ＲＮＡ打点杂交证实ｇｃｙｓ－１８在ＧＣ７９０１中呈高表达,     

背根神经节组织中GAP-43基因克隆

目的：克隆新生大鼠背极神经节组织中生长相关蛋白－４３（ＧＡＰ－４３）基因。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ法,从新生大鼠背根神经节组织ｍＲＮＡ中扩增ＧＡＰ－４３基因ＣＤＳ区片段,克隆入Ｔ载体,并经序列测定。结果：ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出一特异产物与预期长度７７８ｂｐ相符,Ｔ载体克隆测序与ＧＡＰ－４３基因１００％同源。结论：采用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｔ载体技术获得了新生大鼠背根神经节组织中的ＧＡＰ－４３基因克隆。     

日本血吸虫26ku谷胱甘肽硫—转移酶基因的克隆及分析

目的 扩增日本血吸虫２６ｋｕ谷胱甘肽硫－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段,构建其重组原核载体,以研制ＳｊＧＳＴ重组克隆。方法 根据已知基因序列设计一对引物,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因ｃＤＮＡ片段,将其克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）质粒中,并经酶切、ＰＣＲ和测序鉴定。结果 获得ＧＳＴ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）重组克隆。结论 本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆,为进一步研     

人类抗砷相关基因（hARRG）的克隆和表达

克隆并表达人类抗砷基因ｈｕｍａｎ ａｒｓｅｎｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ｈＡＲＲＧ）。方法。从人胎脑中获得ｍＲＮＡ,建立ｃＤＮＡ文库,通过大规模测序克隆出一人类新基因。结果：该基因全长１１７０ｂｐ,读框为（ＯＲＦ）７２３ｂｐ,经序列分析,与中国仓鼠抗砷基因ａｒｓｅｎｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ（ａｓｒ２）同源性达８８％。根据ＯＲＦ上物,ＰＣＲ扩增,扩增产物酶切后     

克隆人胸腺素α原cDNA及RNA二级结构分析和带Xa因子的融？…

目的;克隆表达具有重要生物功能的胸腺素α原ｃＤＮＡ（ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎα,ｈｕＰＴＭＡα）。方法：从健康中国人ＰＢＭＣｐｏｌｙ （Ａ）＾＋ＲＮＡ中采用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆ｈｕＰＴＭＡα ｃＤＮＡ,并作ＲＮＡ二级结构分析。结果克隆出长度为３００ｂｐ,编码１００个氨基酸的ｈｕＰＴＭＡα ｃＤＮＡ,经氨基酸序列分析发现在３７－４１位缺失Ａｓｎ＾３７－Ｇｌｙ＾３８＝Ａｓｎ＾３９－Ａｌａ＾４     

正常SD大鼠心血管系统内皮素转换酶表达水平及意义

目的：探讨正常ＳＤ大鼠心脏及血管（动脉、静脉）内皮素转换酶（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ＥＣＥ）ｍＲＮＡ的分布。方法：半定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测组织中的ＥＣＥ ｍＲＮＡ,同时以甘油醛－３－磷酸脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒ－ａｌｄｅｌｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＧＡＰＤＨ）作内参照。结果：正常ＳＤ大鼠心脏各部位及血管（动脉、静脉）ＥＣＥ ｍＲＮＡ的     

RT-PCR检测血管外膜成纤维细胞中肝细胞生长因子及其受体基因的表达

目的 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠和ＳＤ大鼠为研究对象,从分子水平研究肝细胞生长因子和ｃ－ｍｅｔ在血管外膜成纤维细胞中的表达及其意义。方法 （１）用套式聚合酶链反应及经典ＰＣＲ检测ＨＧＦ及其受体－ｃ－ｍｅｔ基因在血管外膜成纤维细胞中的表达。（２）测定ｃ－ｍｅｔ基因ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序物。结果 （１）ＰＣＲ产物电泳显示ｃ－ｍｅｔ基因在大鼠血管外膜成纤维细胞中有表达。（２）ｃ－ｍｅｔ基因ＰＣＲ产物的序列经ＤＮＡ     

RT—PCR检测血管外膜成纤维细胞中肝细胞生长因子及其受体基因的表达

目的 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠和ＳＤ大鼠为研究对象,从分子水平研究肝细胞生长因子和ｃ－ｍｅｔ在血管外膜成纤维细胞中的表达及其意义。方法 （１）用套式聚合酶链反应及经典ＰＣＲ检测ＨＧＦ及其受体－ｃ－ｍｅｔ基因在血管外膜成纤维细胞中的表达。（２）测定ｃ－ｍｅｔ基因ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序物。结果 （１）ＰＣＲ产物电泳显示ｃ－ｍｅｔ基因在大鼠血管外膜成纤维细胞中有表达。（２）ｃ－ｍｅｔ基因ＰＣＲ产物的序列经ＤＮＡ     

T—载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的简便方法。方法 用ＰＣＲ方法分别特异性扩增Ｗｉｌｍｓ瘤基因ｗｔ１和尿激酶受体（ＵＰＡＲ）基因,并利用Ｔａｐ聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入Ｔ－载体,ＥｃｏＲＩ酶切鉴定阳性重组子。结果设计的引物可分别扩增ｗｔ１基因锌指区（３４３ｂｐ）和ＵＰＡＲ基因编码区全长（１０８３ｂｐ）;未经修饰的常规ＰＣＲ和高保真ＰＣＲ扩增产物可被直接克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ     

9-顺维甲酸对人肺腺癌细胞维甲酸受体转录的影响

目的：观察９－顺维甲酸（９－ｃｉｓ－ＲＡ）处理前后人肺腺癌细胞株ＰＧ和Ａ５４９维甲酸受体（ＲＡＲｓ）及维甲类Ｘ受体　（ＲＸＲｓ）不同时相ｍＲＮＡ转录水平的表达。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ相对定量检测人肺腺癌细胞株ＰＧ和Ａ５４９加９－ｃｉｓ－ＲＡ前后ＲＡＲｓ和ＲＸＲｓ　ｍＲＮＡ转录水平。结果：应用９－ｃｉｓ－ＲＡ后，两细胞株的ＲＡＲα和ＲＡＲβ－ｍＲＮＡ转录水平较对照组明显增高，其余受体转录无明显变化。结论：受体ＲＡＲα和ＲＡＲβ可能与９－ｃｉｓ－ＲＡ对两细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用有密切关系。     

Akt的PH结构域与其调节区的结合

目的 从人T细胞中克隆Akt的PH结构域及其调节区基因并进行6-his和GST融合表达，研究二者的体外结合情况，为进一步研究Akt的调节区在其分子激活中的作用打下基础。方法 以RT-PCR的方法从人T细胞中扩增目的基因片段，测序证明序列正确，再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pRSET-A和pGEX-4T-1中，以IPTG诱导，获得Akt的PH结构域及其调节区与6-his和GST的融合表达。表达的PH结构域融合蛋白经谷胱甘肽耦联的琼脂糖珠纯化，以pull-down法检测该PH结构域与6-his调节区的结合。结果 Akt的PH结构域和调节区基因序列完全正确。得到与GST和6-his的融合表达，表达产物有较高可溶性。结论 SDS-PAGE检测到PH结构域可在体外与调节区特异地结合。     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

GST-hPBD融合蛋白的克隆、表达及活化Rac1蛋白的分析

目的:制备GST-hPBD融合蛋白,探讨活化的Rac1在血管内皮细胞中的表达. 方法:采用RT-PCR方法克隆与活化Rac1相结合的hPBD基因片段,构建pGEX-2T/hPBD原核表达载体,并纯化GST-hPBD融合蛋白;应用pull down测定血管内皮细胞中活化Rac1的蛋白表达. 结果:基因测序证实原核表达载体pGEX-2T/hPBD序列正确,并在大肠杆菌中高效表达,纯化得到纯度约75% GST-hPBD融合蛋白,其Mr为36 000;进一步分析证实血管内皮细胞可表达活化的Rac1蛋白. 结论:成功构建了人pGEX-2T/hPBD原核表达载体,纯化了GST-hPBD融合蛋白,并检测到血管内皮细胞中活化Rac1蛋白的表达.     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人类5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶N端部分的克隆和表达

目的 :克隆人 5 ,10 亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTH FR)N端部分编码基因 ,构建重组表达载体并对其诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出人胎肝组织MTHFR的N端部分 1116bp的核苷酸序列 ,克隆于载体pGEM Teasy ,测序分析后亚克隆于表达载体pGEX 4T 2 ,构建重组表达载体pGEX MTHFR(N) .结果 :经过转化E .coliJM10 9和BL2 1后 ,诱导表达出Mr 为 66× 10 3的蛋白 .SDS PAGE分析显示 ,表达量占全菌总蛋白质的 3 1%.结论 :获得了人MTHFR(N)编码基因及其原核表达菌株 ,对研究人MTHFR的生物学功能具有重要的意义 .     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

人卵透明带重组融合基因及其表达载体的构建

目的构建人卵透明带蛋白3（zona pelludda 3，ZP3）／GST蛋白融合基因原核表达载体。方法利用PCR法扩增出去N端的信号肽和C端的跨膜区huZP3成熟蛋白编码基因。先将其克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析，然后将huZP3核心DNA片断克隆入GST蛋白融合原核表达载体pGEX4T-1内。结果获得一个核苷酸长度约为1000bp的基因，与GenBank（NCBI：M60504）公布的ZP3基因序列有99％的同源性。DNA序列分析发现。有一个氨基酸出现变异。酶切鉴定后证明ZP3基因完整插入GST融合蛋白原核表达载体pGEX4T-1中。结论成功构建出含ZP3基因的GST融合蛋白原核表达载体。     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

Expression of GST-IL-1 fusion gene

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＳＴ－ＩＬ－１ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅＣｈｅｎＭｅｉｈｏｎｇ（陈梅红）；ＷａｎｇＺｉｌｉｎｇ（王字玲）；ＤｅｎｇＪｉａｎｂｅｉ（邓健蓓）；ＺｈａｏＺｈｏｎｇｌｉａｎｇ（赵忠良）；ＣｈｅｎＮａｎｃｈｕｎ（陈南春）；ＳｕＣｈｅｎｇｚ...