受体相互作用蛋白140对神经胶质细胞生物学行为的影响

目的 明确受体相互作用蛋白140 (RIP140)基因过表达对小鼠小胶质瘤细胞(BV-2)增殖、凋亡、侵袭及迁移行为的影响.方法 采用脂质体转染和G418筛选法构建RIPI40过表达的BV-2细胞模型,用实时定量PCR及Western印迹法鉴定过表达模型构建是否成功,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室检测RIP140过表达对BV-2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移行为的影响.结果 成功构建RIP140过表达模型BV-2-1,BV-2-1细胞RIPI40 mRNA与蛋白表达量均高于BV-2细胞(t＝49.794,P＜0.01).细胞增殖检测显示:BV-2细胞24、48、72 h吸光度(A)值分别为1.157±0.013、1.679±0.005、2.609±0.008,BV-2-1细胞3个时间点的A值分别为0.929±0.013、1.188±0.008、1.528±0.012,BV-2-1细胞48及72 h增殖率明显低于BV-2细胞(t＝6.058、9.245,均P＜0.01).凋亡检测显示:BV-2-1细胞凋亡率明显高于BV-2细胞[(5.35±0.23)％比(3.46±0.45)％,＝6.619、P＝0.003].侵袭检测显示:BV-2-1细胞侵袭平均数多于BV-2细胞[(166±43)个比( 93±32)个,t＝3.403,P＝0.007].迁移检测显示BV-2-1细胞迁移平均数高于BV-2细胞[ (202±50)个比(101±25)个,t＝4.104,P＝0.002].结论 RIP140过表达抑制BV-2细胞增殖,促进其凋亡;RIP140过表达促进BV-2细胞的侵袭和迁移能力.     

受体相互作用蛋白140敲低对小鼠小胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨受体相互作用蛋白(RIP)140基因敲低对小鼠小胶质瘤细胞(BV-2)增殖的影响.方法 用脂质体转染方法将RIP140-短发夹RNA(shRNA)质粒导入BV-2细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达RIP140-shRNA的细胞系,用实时定量PCR和Western印迹法检测RIP140敲低的效果,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RIP140敲低对细胞增殖的影响.结果 成功构建稳定表达RIP140-shRNA的BV-2-71674和BV-2-71080;与BV-2细胞相比,BV-2-71674和BV-2-71080细胞中RIP140的表达无论mRNA水平还是蛋白质水平均明显低,下调率(mRNA)分别为73%和75%(均P<0.01);MTT法检测显示,BV-2细胞在24、48、72、96 h 4个时间点增殖率分别为3.03±0.01、7.36±0.08、14.15±0.25、23.35±0.09,BV-2-71674细胞则分别为2.15±0.03、6.43±0.08、11.77±0.31、18.47±0.04,BV-2-71080细胞分别为1.77±0.03、4.74±0.25、10.03±0.02、17.66±0.21;BV-2-71674和BV-2-71080细胞增殖率均明显低于BV-2细胞,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 RIP140敲低可以抑制BV-2细胞的增殖.     

受体相互作用蛋白140在脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及其作用

目的 探讨受体相互作用蛋白140 (receptor interacting protein140,RIP140)在脓毒症急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及其在炎症反应过程中的作用.方法 36只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组和盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症肺损伤3、6、12、24 h组.HE染色观察肺组织病理变化;免疫组化检测RIP140在肺组织的表达分布;Western blot及免疫荧光观察肺泡巨噬细胞RIP140的表达变化及定位;RT-qPCR测定肺泡巨噬细胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA水平变化.结果 CLP组可见明显肺损伤病理改变且随时间进展逐渐加重.RIP140在脓毒症肺损伤大鼠肺组织中主要表达于炎性渗出细胞,且随时间进展,表达RIP140的细胞数量逐渐增多.CLP术后6h大鼠肺巨噬细胞RIP140蛋白表达水平较正常对照组开始升高(P＜0.05),至12～24 h维持一较高水平,且主要表达于细胞核.CLP术后3h大鼠肺巨噬细胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA水平较正常对照组开始升高(P＜0.05),至12～24 h维持一较高水平,下调肺泡巨噬细胞RIP140的表达可明显抑制IL-1 β、TNF-α、IL-6 mRNA的表达.结论 脓毒症肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞可通过上调RIP140表达增强肺组织炎症反应,从而参与早期急性肺损伤的炎症应答.     

表面活性蛋白A在星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达及炎症调节作用

目的探讨表面活性蛋白A (SPA)在星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达及其炎症调节作用。方法分别采用免疫荧光双染和免疫组织化学染色法检测SPA在健康大鼠脑组织的星形胶质细胞、体外培养的星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达情况。采用不同浓度(1、5、10μg/mL)脂多糖(LPS)培养液培养人星形胶质细胞及小胶质细胞24 h,10μg/mL LPS培养液培养人星形胶质细胞及小胶质细胞2、4、8、16、24 h,采用Western blotting检测细胞中SPA的表达情况。将人星形胶质细胞及小胶质细胞随机各分为LPS组(含有5μg/mL LPS的培养液)、LPS+SPA组(含有5μg/mL LPS和0.5μg/mL SPA的培养液)、SPA组(含有0.5μg/mL SPA的培养液)和对照组(未加入任何处理因素的培养基)。各组细胞培养8 h,采用Western blotting检测各组细胞中TLR4和NF-κB p65蛋白表达;ELISA法检测各组培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果 SPA在大鼠脑组织的星形胶质细胞中表达,在体外培养的人星形胶质细胞和...     

小胶质细胞受体与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)是一种以认知与其它机能进行性减退为主要特征的神经系统退行性病变。越来越多的证据表明,炎症反应在AD的病理进程中起了重要的作用。小胶质细胞为脑内固有吞噬细胞,可表达多种受体;β-淀粉样蛋白(Aβ)通过与上述受体的相互作用促进小胶质细胞的活化,刺激炎症反应产生。本文就近年来关于小胶质细胞受体在AD发生发展中的作用作一综述。     

刺伤对星形胶质细胞胶质酸性蛋白表达的影响

目的观察刺伤对星形胶质细胞及其胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的影响。方法用腹腔注射速眠新和氯胺酮联合麻醉,微型钻钻孔造模,利用免疫组织化学方法和图像分析仪,观察刺伤后的星形胶质细胞的密度及其胶质酸性蛋白表达的变化,并与未刺伤组作对照分析。结果 GFAP阳性细胞在二组星形胶质细胞中均有分布;刺伤组星形胶质细胞的密度比未刺伤组增加（P〈0.05）,GFAP阳性细胞的平均光密度值（OD值）,刺伤组高于未刺伤组（P〈0.01）。结论刺伤星形胶质细胞后可以引起其数量及其胶质酸性蛋白的表达增加,可能是星形胶质细胞对刺伤的一种保护性反应。     

小胶质细胞上P2X受体在神经病理性疼痛中的作用

神经病理性疼痛是由外周和中枢神经系统损伤所引起的疼痛,这些损伤包括糖尿病性神经病变、病毒感染和脊髓损伤等[1].其特点是弱或无伤害的轻微刺激就可以引起剧烈的疼痛感受,与中枢和外周神经重塑性有关.     

小鼠脊髓源原代星形胶质细胞与小胶质细胞的同步培养及鉴定

目的 建立一种简便、高效可同时得到小鼠脊髓源的原代星形胶质细胞与小胶质细胞的分离、纯化、培养方法.方法 显微镜下剥离胎鼠脊髓,剪碎后经机械吹打、自然沉降制成细胞悬液,接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养得到混合胶质细胞;当细胞汇合度>90％时,采用恒温定轨摇床振荡结合传代除杂的方法获...     

受体相互作用相关蛋白140在正常小鼠脑发育过程中的表达

目的了解受体相互作用相关蛋白（RIP）140在正常小鼠脑发育时期的表达情况。方法应用免疫组化方法研究RIP140在脑组织中的定位,并应用实时定量PCR和Western印迹研究RIP140在正常小鼠不同发育时期的动态表达模式。结果免疫组化结果显示RIP140在正常小鼠脑发育过程中始终存在表达,且在大脑皮质、海马、丘脑等部位有明确的表达。实时定量PCR结果显示RIP140 mRNA在正常小鼠脑不同发育时期的表达呈现动态变化模式,Western印迹结果示RIP140蛋白在小鼠脑不同发育时期的表达也呈现动态变化模式,且与mRNA的表达具有正相关性（rs=0．767,P=0．016〈双侧〉）。结论RIP140参与了正常小鼠脑发育和脑功能的行使。     

Toll样受体在视网膜缺血小胶质细胞激活过程中的作用

Toll样受体(TLRs)是模式识别受体的一类,其能够特异性识别病原体相关模式分子,激活TLRs通路,分泌促炎性细胞因子,从而引起神经细胞的变性损伤。视网膜缺血性损伤是多因素综合作用的结果,而近年的研究越来越重视激活的小胶质细胞在视网膜缺血损伤中的作用,激活的小胶质细胞通过TLRs介导炎症信号通路,诱导神经损伤,形成视网膜慢性炎症环境。而视网膜慢性炎症环境是糖尿病视网膜病变、青光眼等视网膜缺血性疾病的共同病理过程。未来可通过对TLRs所介导信号通路的深入研究,探寻潜在的治疗手段去抑制TLRs介导的炎症信号通路和小胶质细胞激活,从而减轻视网膜缺血性损伤的病理改变。     

过表达RIP140的肿瘤相关巨噬细胞抑制肝癌细胞的侵袭和增殖

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中RIP140 的表达对肝癌细胞侵袭、增殖的影响。方法慢病毒介导小鼠腹腔巨 噬细胞（PMs）RIP140 的过表达,Western blot 和Real-time PCR（qRT-PCR）分别检测PMs中RIP140 蛋白以及核酸表达水平, 流式细胞仪分析慢病毒转染率;Western blot、细胞免疫荧光和qRT-PCR 检测肝癌条件培养基（HCM）刺激PMs 后TAMs中 RIP140 的表达变化;HCM刺激PMs以及HCM刺激过表达RIP140 的PMs,qRT-PCR检测TAMs极化指标以及NF-κB和IL-6 的表达;Transwell 实验和细胞流式凋亡实验检测肝癌细胞的侵袭和凋亡;肝癌细胞和PMs以4∶1 比例注射于BALB/c裸鼠皮 下,建立裸鼠皮下肝癌模型,成瘤癌组织HE染色和免疫组化评定肝癌组织大体生长情况和肝癌细胞增殖能力。结果慢病 毒介导PMs RIP140 的过表达,病毒转染效率高,RIP140 过表达明显;HCM刺激PMs后,TAMs中RIP140 呈低表达;HCM诱 导TAMs呈M2 型极化,并且与肿瘤生长密切相关的NF-κB-IL-6 轴处于活化状态;TAMs可促进肝癌细胞侵袭和增殖,抑制 肝癌细胞凋亡。TAMs过表达RIP140 可抑制HCM介导的TAMs M2 型极化并抑制NF-κB/IL-6 通路的激活,减少IL-6 的释 放;除此之外,TAMs过表达RIP140 可抑制肝癌细胞的侵袭和增殖,促进肝癌细胞的凋亡。结论过表达RIP140 的TAMs可 抑制肝癌细胞的侵袭和增殖。其机制可能与TAMs过表达RIP140后抑制TAMs M2型极化有关。     

miR-140在内耳毛细胞中的表达及其对突触蛋白Dynamin-1的调控作用

目的 研究miR-140在正常小鼠内耳毛细胞的表达分布及其对编码突触蛋白Dynamin-1的Dnm1基因的靶向调控作用.方法 取正常成年C57BL/6小鼠耳蜗基底膜,免疫荧光染色和原位杂交法观察Dynamin-1与miR-140的表达定位情况.构建荧光素酶报告基因载体转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确Dnm1是否是miR-140的靶基因.携带miR-140前体及空载的腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV) 通过圆窗膜注射传递到耳蜗中, 14 d后RT-PCR检测miR-140及Dnm1的mRNA表达水平,Western blot检测Dynamin-1蛋白的表达水平.结果 miR-140表达于内外毛细胞细胞质,Dynamin-1主要表达于内毛细胞细胞质;荧光素酶活性检测结果 显示,miR-140抑制Dnm1的3'UTR荧光素酶报告基因活性(P＜ 0.05) .RT-PCR及Western blot检测结果 显示: 转染AAV-miR-140后miR-140的相对表达量明显升高,Dnm1的mRNA及其蛋白表达水平显著降低(P＜ 0.05) .结论 Dnm1是miR-140的靶基因,且miR-140可以抑制内耳毛细胞中Dynamin-1的表达,表明miR-140可能通过抑制Dynamin-1蛋白负向调控内毛细胞突触囊泡内吞过程,进而影响听觉信号的传递.     

Gene transfer into hematopoietic cells of mouse and itsin vivo expression after transplantation

Summary We have shown previously that high-efficient gene transfer can be attained in primary hematopoietic cells using liposome-mediated gene transfer strategy. In order to examine the stability of gene expression mediated by this gene transduction protocol, we observed the expression of marker genein vivo by using bone marrow transplantation (BMT) to engraft lethally irradiated mouse with the genetically modified hematopoietic cells. The results showed that the mouse transplanted with appropriated number of transduced cells remained alive and healthy. The PCR analysis and G418 selection of the spleen colonies and bone marrow cells isolated from lethally irradiated animals 15 days and 30 days after injection of genetically modified bone marrow cells showed that the progeny cells of the transduced hematopoietic stem cells still contained and expressed the transduced genes, suggesting that the hematopoietic system is at least partially re-constructed by the stem cells with marker gene and that the stable expression of foreign genesin vivo can be attained by using this easy and harmless transduction protocol. These findings provide experimental basis for clinician to further investigate the biology of marrow reconstruction and the mechanism of leukemia relapse after BMT. This project was supported by the grant of Scientific Research Foundation of Public Health Ministry (320. 2430-330).     

激活素受体相互作用蛋白4的基因克隆

目的：克隆新的与激活素受体ⅡA（ActRⅡA）相互作用蛋白,即激活素受体相互作用蛋白4 （ActRIP4）基因。方法：应用ActRIP2基因片段作为探针,从小鼠cDNA文库中钓取ActRIP4 cDNA;采用哺乳细胞双杂交进一步确定ActRIP4 与ActRⅡA的相互作用;RT-PCR检测ActRIP4 mRNA在组织中的表达情况。结果：克隆的ActRIP4基因全长691bp,ORF区编码 118个氨基酸残基;ActRIP4与ActRⅡA具有特异性结合作用;天然的ActRIP4 mRNA在小鼠多种组织中表达。结论：ActRIP4属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用,可能在多种组织中介导激活素受体信号传导过程。     

Gene expression profiling of the proliferative effect of periplocin on mouse cardiac microvascular endothelial cells

<正>Objective:Periplocin is an active digitalis-like component from Cortex Periplocae,which has been widely used in the treatment of heart diseases in China for many years.According to the recommendations on the cardiovascular effect of periplocin from in vivo experiments,subsequent in vitro experiments are greatly needed for the global assessment of periplocin.The objective of this study is to investigate the cell proliferation effect and the mechanism of periplocin on endothelial cells.Methods:The proliferative activity of periplocin(0.4, 2,10,50,250μmol/L;6,12,24,48,72 h) was investigated by a comparison with the well-reported cardiac glycoside,ouabain,on mouse cardiac microvascular endothelial cells(CMEC).3-(4,5-dimethylthiazolyl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT),lactate dehydrogenase(LDH) and 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU) assays were used to evaluate cell proliferation and viability.Subsequently,cDNA microarray experiments were performed on periplocin-(50μmol/L) and ouabain-(50μmol/L) treated cells,and data was analyzed by ArrayTrack software.Results:Periplocin could increase cell viability to a level lower than ouabain in the MTT analysis,but decrease LDH release simultaneously.The BrdU incorporation assay showed an increase in cell proliferation with 2-50μmol/L periplocin.Genes related to protein serine/threonine kinase were the most significantly enriched in the 160 genes identified in periplocin versus the control.In the 165 genes regulated by periplocin versus ouabain,GTP-binding was the most altered term.Conclusions:The results demonstrated the proliferation action of periplocin on CMEC.Meanwhile,its lower cytotoxicity compared to ouabain provides a new insight into the treatment of heart failure.     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

缺氧增加小鼠小胶质细胞IRAK-4的表达

目的 观察缺氧后小鼠小胶质细胞株N9对白细胞介素-1受体相关激酶4( interleukin-1 receptor associated kinase-4, IRAK-4)表达的变化,探讨小胶质细胞内炎症反应的相关机制.方法 将培养的N9细胞置于低氧(3%O2,5%CO2,92%N2)条件下培养1、3、6、12、24 h,用Western blot检测蛋白表达的变化,用激光共聚焦技术观察IRAK-4在细胞内表达变化情况,用酶联免疫吸附法检测培养液上清肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量.结果 N9细胞IRAK-4的蛋白表达随缺氧时间延长而逐渐增高,1 h开始增加,3 h增加明显(P<0 01),6 h达高峰,12 h仍维持在较高水平(P<0 01),24 h 下降与常氧无显著性差异(P>0 05).激光共聚焦也显示随着缺氧时间的延长,荧光强度逐渐加强.培养液上清TNF-α含量的变化也符合相似的变化趋势.IRAK-4蛋白表达水平与培养液上清TNF-α含量的变化呈显著的正相关(r=0.863, P<0 05).结论 缺氧可以增加小鼠小胶质细胞内IRAK-4的蛋白表达,提示中枢神经系统内存在对免疫反应起着调控作用的TLR/IL-1R家族信号转导系统,调控下游炎症反应.     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。