枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的发酵条件优化分析

为获得枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的最佳发酵条件,分别对碳源、氮源、碳氮质量比、发酵时间和培养温度进行了单因素实验,在此基础上对发酵温度、接种量、培养基初始pH值和发酵时间四因素进行了L9(34)正交优化试验.结果表明枯草芽孢杆菌分泌β-甘露聚糖酶的最佳碳源为40 g/L魔芋精粉,最佳氮源为5 g/L酵母抽提物,两者最佳质量比为5∶1,最佳发酵条件为30℃的条件下摇瓶培养28 h;最佳发酵参数组合为发酵温度30℃、接种量5%、培养基初始pH6.5、发酵时间28 h;各因素对枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的影响程度大小依次为发酵时间>发酵温度>接种量>培养基初始pH,其中发酵时间对产酶的影响最为显著.     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH_4)_2SO_4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH_4)_2SO_4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0～7.0,热稳定范围在35～55℃之间;Ca~(2+),Ba~(2+),Mg~(2+),K~+,Co~(2+)对酶都有激活作用,而Ca~(2+)激活作用最强,Cu~(2+),Na~+,Zn~(2+),Mn~(2+),EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.     

点突变对枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶结构和功能的影响

目的研究定点突变对枯草芽孢杆菌B23所产生的甘露聚糖酶活性及蛋白结构的影响,深入了解该酶结构与功能间的关系,为其分子改造提供理论依据。方法通过与同源酶蛋白序列的比较和分析,在同源性较高的色氨酸第196、198和199位点上,天冬氨酸第91位点上和谷氨酸第191位点上通过特异引物引入突变,PCR扩增获得甘露聚糖酶的突变基因,B.subtilis WB800为表达载体,纯化相应的诱变蛋白,测定其酶活性及荧光光谱变化。结果三个色氨酸突变体蛋白[Man(W196H)、Man(W198H)、Man(W199H)和Man(W199A)]核的活性均有所下降,其中Man(W199H)突变体酶活力几乎丧失,为突变前的4%。Man(D91N)和Man(E191Q)的酶活力也分别降至突变前的10%和12%。结论W199、D91和E191是酶活性的必需基团,对其造成的突变对甘露聚糖酶的结构和活性有显著影响。     

嗜碱芽孢杆菌NTT33β-甘露聚糖酶的特性研究

本文研究了嗜碱芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ） Ｎ Ｔ Ｔ３３β－ 甘露聚糖酶的产生条件和酶学性质．其产酶的最佳碳源为 １％ 槐豆角,最佳氮源为 １％ 蛋白胨＋ ０．２％ 酵母膏,发酵培养３６ｈ 产酶量最高（达 ６１．３ｕ／ｍ ｌ）．甘油、葡萄糖、甘露醇等对产酶有强的阻遏作用．经分离纯化后测得纯酶的分子量为３８．９ Ｋ Ｄ,等电点 ｐ Ｉ为３．０,酶反应最适 ｐ Ｈ 为 ９．０～１０．０,最适温度为８０℃,稳定 ｐ Ｈ 为６．０～９．０,稳定温度为６０℃以下,金属离子中 Ｃｕ２＋ , Ｂａ２＋ , Ｍ ｇ２＋ , Ａｌ３＋ , Ｃｏ２＋ 对该酶有一定的激活作用,而 Ａｇ＋ , Ｈｇ２＋ , Ｍｎ２＋ 对该酶有明显抑制作用     

枯草芽孢杆菌β—甘露聚糖酶的三种纯化方法研究

分别采用硫酸铵盐析法,丙酮沉淀法,聚乙二醇沉淀法对枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｋ３－１４菌株发酵产生的β－甘露聚糖酶（β－ｍａｎｎａｎａｓｅ）进行提纯．其中硫酸铵盐析法在６０％饱和度时提纯９．１８倍,比活力为１６９．２０Ｕ／ｍｇ;丙酮沉淀法在用量体积分数１．０∶１时提纯１０．４３倍,比活力为１９２．３１Ｕ／ｍｇ;聚乙二醇沉淀法在０．３５ｇ／ｍｌ浓度时提纯１４．６８倍,比活力为２７０．６９Ｕ／ｍｇ．提纯后的β－甘露聚糖酶制品经电泳鉴定呈四条蛋白带．     

丙酮沉淀法提取β-甘露聚糖酶的研究

为获得纯度较高的β-甘露聚糖酶,采用丙酮沉淀法提取β-甘露聚糖酶,并研究了丙酮用量、温度及时间对提取β-甘露聚糖酶的影响.结果表明V粗酶液∶V丙酮为1∶1.6,-20℃,5 h最高提取率达75.81%,提取后的酶活比原始酶活高152倍,酶活随提取温度降低、反应时间的缩短而升高.     

β-甘露聚糖酶菌株的复合诱变选育及发酵条件的优化

利用离子注入和紫外线复合诱变，筛选到了一株产β－甘露聚糖酶的优良枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M－66，作者采用“系统全面反馈实验优化技术”优化了发酵条件，并使其发酵液酶活从出发菌株M－1的37.03U/mL提高到优化后的150.12U/mL。     

泡桐内生枯草芽孢杆菌JDB-1草菌素的抑菌活性及其spaS基因的克隆

用硫酸铵沉淀法从泡桐内生枯草芽孢杆菌JDB-1发酵液中粗提枯草菌素,采用纸片扩散法和琼脂糖扩散法分别检测枯草菌素对细菌和真菌的抑菌活性,采用PCR从菌株JDB-1基因组DNA中扩增出枯草菌素基因spaS,并克隆到pMD18-T载体,测定spaS基因的核苷酸序列.结果表明硫酸铵粗提的枯草菌素对大肠杆菌K12、恶臭假单胞杆...     

转β-甘露聚糖酶基因大肠杆菌在猪肠道内的外泌型表达

从里氏木霉R u t C-30提取总RNA,用RT-PCR方法克隆到β-甘露聚糖酶成熟肽cD-NA,并将其E coRΙ和B amH I酶切后连接到克隆载体pGEM进行测序,结果与G enB ank公布的完全一致,随后将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-M anΙ经E coRΙ、绿豆芽核酸酶、H indⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T 7启动子以及信号肽Om pT序列的分泌型表达载体pTOO 2连接,构建成表达载体pTOO 2-M an.Ι然后利用大肠杆菌素释放基因(k il)能有效的增加细菌外膜通透性促进周质蛋白外泌的原理,再将表达载体pTOO 2-M anΙ和质粒pUC 18-k il共转化到大肠杆菌BL 21株中,构建成外泌型表达体系BL 21-pTOO 2-M anΙ/pUC 18-k il进行外泌型表达.表达产物经酶活鉴定具有明显的β-甘露聚糖酶活性,经EL ISA双抗夹心法检测,无论在体外或猪肠道内容物内均为阳性,从而实现了该基因的外泌型表达;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,分子量为50.98 kD和53.98 kD,该工程菌通过瘘管灌注到猪肠道内进行表达研究,结果基本令人满意.从而实现了该转基因大肠杆菌在猪肠道中外泌型表达的目的.     

培养基组成对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响

通过改变产酶培养基中的营养成分与比例,采用酶活力测定方法,分析培养基中的碳源种类和浓度、氮源组成、碳氮比(mC:mN)等主要因素对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响。结果表明,20 g/L微晶纤维素为碳源、含氮素质量比为1∶1的硫酸铵和尿素为氮源、mC:mN=4的培养基组成,是里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳条件。在此条件下β-甘露聚糖酶酶活力在发酵96 h时达到最大,β-甘露聚糖酶酶活力和β-甘露糖苷酶酶活力分别为4.48、0.04μmol/(min.mL)。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术扩增得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段，并构建重组质粒pUC-T-GDH，然后将基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pBV220中．得到表达质粒pBV-GDH．葡萄糖脱氢酶在含有表达质粒的基因工程菌株中得以诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描结果表明，经诱导表达的葡萄糖脱氢酶约占基因工程菌株总蛋白的45％．葡萄糖脱氢酶活力测试表明，基因工程菌株无细胞抽提液中葡萄糖脱氢酶的活力为7.8U／毫克，约为对照组的30倍．实验结果初步说明，广泛应用于工业化生产的葡萄糖脱氢酶可以在基因工程菌株中得以大量表达并维持较高活力．     

丙酮沉淀法提取中性β-甘露聚糖酶的条件研究

利用丙酮沉淀提取枯草芽孢杆菌Ｋ３－１４发酵产生的中性β－甘露聚糖酶－２０℃时Ｖ（发酵液）：Ｖ（丙酮）用量为１：１．０时,提取率为８２．５７％,固体酶制酶活力为１９．４３万Ｕ／ｇ,１：２．０时提取率为９５．４０ｇ,所得固体酶净重增加此工艺在工业上是可行的。     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

保护剂提高β-甘露聚糖酶热稳定性的研究

研究了几种糖类（葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖和壳聚糖）和多元醇类（乙醇、丙三醇和山梨醇）保护剂提高肛甘露聚糖酶热稳定性的作用,并考察了在特定保护剂存在时该酶的最适反应温度和失活热力学以及动力学．实验表明,蔗糖、壳聚糖和山梨醇在浓度均为2g/L时能够显著提高该酶的热稳定性;通过正交实验得到了一种效果最佳的复合保护剂（蔗糖、壳聚糖、山梨醇之比为1：2：2）;蔗糖、壳聚糖、甘油、山梨醇和复合保护剂的添加均能使β-甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的50℃提高到60℃左右;65℃下β-甘露聚糖酶的热失活曲线遵循一级反应规律,计算得到了不同保护剂下酶失活的动力学和热力学参数值,并分析了保护剂提高β-甘露聚糖酶热稳定性的机理．     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

枯草芽孢杆菌TF2磺胺胍抗性基因的克隆和表达

采用鸟枪法将枯草芽孢杆菌磺胺胍抗性基因克隆到质粒ｐＵＢ１１０中建成重组质粒,ｐＢＵＷ４,该质粒的分子量约８．１ｋｂ,标记为ＳＧ＾ｒ为Ｋｍ＾ｒ,将ｐＵＢＷ４转化到肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Ｑ２９０１－４菌株中,得到的转化子产肌苷能力比受体菌提高２５．５％。     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。