河田鸡与艾维菌肉鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特性比较

河田鸡和艾维菌肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54．84U·rag～,纯化倍数为8．86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）制剂．艾维菌肉鸡睾丸NAGase经SephacryS-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171．50U·mg-1,纯化倍数为19．8倍的NAGase制剂．以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学．结果表明：河田鸡和艾维菌肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5．6、5．7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3．0—9．2、4．0-9．2及温度为10-60、10-30℃下能保持稳定;NAGase酶促反应动力学均符合米氏双曲线方程,测得米氏常数（k）分别为0．223、0．319mmol·L-1,最大反应速度（k）分别为9．438、6．238μmol·L-1·min-1;NAGase催化pNP-NAG反应的活化能分别为85．74、73．47kJ·mol-1．     

醇、醛类有机物对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以甲醇、乙醇、异丙醇、甲醛和戊二醛为效应物,研究它们对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:戊二醛对NAGase活力影响不大;低浓度的甲醇和乙醇对NAGase有激活作用;高浓度的甲醇、乙醇、异丙醇和甲醛对NAGase的作用为可逆抑制.甲醇、乙醇、异丙醇对NAGase表现出竞争性抑制,抑制常数(KI)分别为3.663、0.360和0.480 mol.L-1;甲醛表现为非竞争性抑制类型,其KI为0.288 mol.L-1.     

亚硫酸钠、过氧化氢和尿素对河蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

以亚硫酸钠(Na2SO3)、过氧化氢(H2O2)和尿素为效应物,研究它们对河蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明,Na2SO3、H2O2和尿素对酶活力有不同程度的抑制作用.Na2SO3和H2O2对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,它们对游离酶的抑制常数(KI)分别为254.00和136.78 mmol.L-1;尿素对酶的抑制表现为可逆的混合型抑制,它对游离酶的KI和对酶—底物复合物的抑制常数(KIS)分别为379.02和1182.00 mmol.L-1.     

猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化与酶学性质研究

 【目的】分离纯化猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂,研究其理化性质。【方法】采用硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32阴离子交换柱层析、Sephadex G-100分子筛柱层析和CM-52阳离子交换柱层析方法,分离纯化猪精液的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶分子量测定;采用聚丙烯酰胺等电聚焦圆盘电泳法测定酶的等电点。【结果】经分离纯化获得比活力为17 606.15 U•mg-1、纯化倍数为270.53倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶催化对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖（pNP-NAG）水解的最适pH为5.5,最适温度为50℃。该酶在pH 3.0～8.9区域较稳定;在45℃以下处理30 min,酶活力保持稳定。酶分子中亚基的分子量为58.03 kD,等电点为9.42。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为1.94 mmol•L-1,最大反应速度Vm为27.53 µmol•L-1•min-1。酶催化pNP-NAG反应的活化能为88.73 kJ•mol-1。【结论】本试验选用的分离纯化的方法是可行的。     

醇、醛类有机物对中华绒螯蟹N-乙酰毋-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以甲醇、乙醇、异丙醇、甲醛和戊二醛为效应物，研究它们对中华绒螯蟹N·乙酰·归国·氨基葡萄糖苷酶（NAGase）活力的影响．结果表明：戊二醛对NAGase活力影响不大；低浓度的甲醇和乙醇对NAGase有激活作用；高浓度的甲醇、乙醇、异丙醇和甲醛对NAGase的作用为可逆抑制．甲醇、乙醇、异丙醇对NAGase表现出竞争性抑制，抑制常数（K）分别为3．663、0．360和0．480mol·L^-1；甲醛表现为非竞争性抑制类型，其K1为0．288mol·L^-1．     

单糖对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以D-果糖、葡萄糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)为效应物,研究它们对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.3.1.52)活力的影响及抑制机理.结果表明:在特定浓度范围内,低浓度的葡萄糖对NAGase活力表现为激活作用,而D-果糖、D-甘露糖和NAG对酶活力均表现为抑制作用,抑制程度从高到低依次为D-甘露糖、NAG、D-果糖;D-甘露糖表现为可逆的竞争型抑制,抑制常数KI为18.36 mmol·L-1;NAG表现为可逆的混合型抑制,抑制常数KI和KIS分别为16.98和55.26 mmol·L-1.     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5.70和5.60,酶在pH为3.00-8.43时较稳定,而pH>8.43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活.睾丸NAGase在40℃下处理30 min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30 min,酶活力保持稳定,酶催化pNP-NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的Km分别为0.17和0.21 mmol.L-1,Vm分别为8.82和7.25μmol.L-1.min-1,活化能分别为57.57和79.47 kJ.mol-1.     

菊花总黄酮对凡纳滨对虾N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的效应

为菊花在凡纳滨对虾健康养殖、疾病预防和饲料添加方面的开发利用提供参考,通过乙醇回流法提取菊花总黄酮,以提取物为效应物研究其对凡纳滨对虾N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响。结果表明:菊花总黄酮提取物对NAGase活力具有明显的抑制作用,其抑制作用属可逆的竞争型抑制,抑制常数KI为0.35mg/mL。     

CpG-ODN对山羊实验性乳腺炎乳中NAGase、MPO及乳铁蛋白的影响

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,产后第5、8灭分别向左、右乳区灌注等体积的灭菌PBS和10 μg·kg-1CpG-ODN(cytosine-phosphate-guanosine dinucleotides) ,第9天于左、右乳区经乳导管灌注大肠杆菌(2 × 109CFU·mL-1) 和金黄色葡萄球菌(2 × 109CFU·mL-1) 混合菌液3 mL.分别于灌注细菌前0 h,灌注后8、16、24、48和72 h采集乳样,动态监测乳中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase) 和髓过氧化物酶(MPO) 的活力及乳铁蛋白含量变化.灌注72 h后处死动物,取乳腺组织进行组织学观察.结果显示:灌注细菌后72 h,灌注PBS的乳腺腺泡内仍有大量嗜中性粒细胞浸润,但灌注CpG-ODN的乳区已无明显细胞浸润.灌注CpG-ODN侧乳中NAGase、MPO活性均随时间变化先上升后下降,在24 h达到最大值,乳铁蛋白含量则在16 h达到最高.灌注PBS的侧乳中NAGase、MPO活性随时间变化表现出相同的规律,但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN的一侧,MPO峰值低于灌注CpG-ODN的一侧;乳铁蛋白含量在24 h达到最大,峰值也有所升高.上述结果表明,CpG-ODN可以增强乳腺对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合感染诱导的山羊实验性乳腺炎的非特异性防御能力,减轻乳腺L皮细胞的损伤.     

全氟己酸对罗非鱼肝脏NAGase的抑制动力学

对罗非鱼肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)在全氟己酸中水解pNP-NAG活力的影响进行了研究.结果表明,全氟己酸对NAGase具有可逆抑制,IC_(50)为0.29 mg·mL~(-1).应用Lineweaver-Burk双倒数法可知,全氟己酸对NAGase的抑制类型为竞争型抑制,与自由酶结合的抑制平衡常数(K_I)为0.18 mg·mL~(-1).采用底物反应的动力学方法建立全氟己酸对NAGase的抑制动力学模型,其微观速度常数可以在全氟己酸对NAGase的底物反应中求出.     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰够-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase,EC3．2．1．52）比活力为85．30U·mg-1,纯化倍数为10．48．睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537．00U·mg-1,纯化倍数为59．20．睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点p,为5．05．以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP—NAG）为底物研究酶催化底物水解的反应动力学．结果表明：山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5．70和5．60,酶在pH为3．00—8．43时较稳定,而pH〉8．43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活．睾丸NAGase在40℃下处理30min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30min,酶活力保持稳定,酶催化pNP．NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的K分别为0．17和0．21mmol·L-1,k分别为8．82和7．25p．mol·L-1·min-1,活化能分别为57．57和79．47kJ·mol-1．     

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac~(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL~(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s~(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。     

茶叶提取物对N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的调控

采用乙醇浸提法提取绿茶中的有效物质,紫外光谱特征显示,提取物主成分为二氢黄酮类物质;绿茶提取物对N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性具有显著的抑制作用;绿茶提取物对NAGase的作用属可逆的竞争型抑制,抑制常数K1为0.16 mg/mL.     

萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因的克隆与分析

[目的]对萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因进行克隆与分析。[方法]以萝芙木为材料,采用RACE技术,从萝芙木中克隆SGD的全长cDNA,并对其进行表达谱分析和相关生物信息学分析。[结果]萝芙木SGD基因cDNA全长1 856 bp,包含1 608 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,预测分子量为61 kDa,等电点pI为6.16;生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的3个保守氨基酸催化位点His-161、Glu-207和Glu-419;荧光定量PCR表明,RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。[结论]RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。     

大型潘N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性

为制备免疫原以测量个体生长和繁殖过程中所释放的几丁质酶,从大型潘（Daphniamagna）体内提纯了N．乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（EC3．2．1．52）,经硫酸铵沉淀分级分离、DEAESephadex A-25阴离子交换柱层析和SephadexG-150分子筛柱层析纯化等步骤,酶的纯化倍数为20．09。纯酶比活力为2243380U·mg^-1。酶分子中各亚基的分子量分别为128,99和71Ku。根据测试,酶促反应的米氏常数为0．300mmol·L～,最大反应速度为0．072um01．mg^-1·min^-1。酶催化底物分解的最适pH为7．0,最适反应温度为45℃;酶在值4．2-7．8的范围内活性处于高位;在不高于35℃的温度下处理30min,酶活性下降不明显。至于从大型潘培养液中获得的NAGase,其催化底物分解的最适pH值为7．4,最适反应温度为40℃,该酶在pH值4．6-7．8的范围内活性处于高位,在不高于40℃下处理30min,酶活性下降不明显。这显示被提纯的酶和培养液中分离的酶在温度、pH以及热稳定性和酸碱稳定性方面均具有较高程度的相似性,有可能属于相同分子型。     

血清胱抑素C联合尿N-乙酰-?-D-氨基-葡萄糖胺酶检测对过敏性紫癜早期肾损害的诊断意义

目的探讨检测血清胱抑素C(CysC)和尿N-乙酰-?-D-氨基-葡萄糖胺酶(NAG)在过敏性紫癜(HSP)患儿早期肾损害诊断中的临床意义。方法液相透射比浊法检测52例HSP患儿(观察组)的血清CysC,比色法法检测其尿NAG,同时检测尿常规和血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr),并与30例门诊健康体检的儿童(对照组)进行比较。结果观察组患儿入院时血BUN(4.25±0.65)mmol/L,血Scr(50.29±12.43)μmol/L,均处于正常范围。观察组患儿入院时血清CysC和尿NAG水平明显高于对照组(P<0.01);观察组患儿血清CysC单项检测异常率61.5%(32/52),尿NAG单项检测异常率57.6%(30/52),联合检测异常率为80.7%(42/52),联合检测异常率明显高于单项检测(P<0.05)。结论血清CysC、尿NAG联合检测比BUN、Scr、尿常规等传统指标更加灵敏地反映出HSP患儿肾功能早期损伤及程度。     

β-半乳糖苷酶研究进展

随着生物技术的发展,β-半乳糖苷酶不仅在食品工业中的用途越来越广泛,在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程等方面也都发挥着重要作用,并开始广泛应用于医药等领域。文章对β-半乳糖苷酶的性质、来源、作用机理、应用情况等进行概述,着重介绍了β-半乳糖苷酶在研究上的新进展和应用上的一些新领域。     

萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因的克隆与分析(英文)

[目的]对萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因进行克隆与分析。[方法]以萝芙木为材料,采用RACE技术,从萝芙木中克隆SGD的全长cDNA,并对其进行表达谱分析和相关生物信息学分析。[结果]萝芙木SGD基因cDNA全长1856bp,包含1608bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,预测分子量为61kDa,等电点pI为6.16;生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的3个保守氨基酸催化位点His-161、Glu-207和Glu-419;荧光定量PCR表明,RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。[结论]RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。     

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β-葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase or cellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株．在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高．随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化．通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16．3．CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6．0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17．34mg／ml．