携带socs3基因的溶瘤腺病毒的构建及体外抗肿瘤活性的研究

SOCS3（suppressor of cytokine signaling 3）是JAK/STAT信号通路的负调控因子,SOCS3间接调控的STAT3磷酸化与肿瘤的发生密切相关。本试验构建携带socs3的溶瘤腺病毒AdCN305-SOCS3,在细胞水平研究socs3对肿瘤的抑制作用,并评估AdCN305-SOCS3的抗肿瘤效果。该病毒感染多种肿瘤细胞,均能特异性扩增,同时表达功能正常的SOCS3蛋白,从而抑制STAT3磷酸化,引起肿瘤细胞的明显凋亡。对AdCN305-SOCS3的研究,证实SOCS3蛋白和AdCN305-SOCS3病毒都具有抗肿瘤的功能,在肿瘤的靶向基因治疗研究中具有广阔的应用前景。     

Survivin启动子介导的溶瘤腺病毒载体抗肿瘤研究

肿瘤特异性启动子用于调控溶瘤腺病毒载体靶向于肿瘤细胞,从而实现对肿瘤组织的特异性杀伤,肿瘤特异性启动子的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略.利用肿瘤靶向人源Survivin 启动子构建的重组腺病毒Ad.SP-E1A展开对多种肿瘤细胞和正常细胞杀伤实验研究,结果发现:Ad.SP-E1A具有较高的肿瘤靶向杀伤能力以及对正常细胞无毒副作用,为基因病毒治疗平台中选择高效安全的腺病毒载体提供参考.     

携带Kallistatin的溶瘤腺病毒载体构建及其对肝癌细胞的体外杀伤效应

采用靶向基因-病毒治疗策略,通过同源重组的方式构建了携带Kallistatin（KAL）的重组溶瘤腺病毒ZD55-KAL,并研究其对肝癌细胞的杀伤作用。通过PCR方法鉴定病毒构建正确;MTT法检测病毒对肝癌细胞的杀伤能力和对正常细胞的安全性;结晶紫染色观察细胞凋亡现象。结果显示：经目的病毒ZD55-KAL感染后肝癌细胞出现明显的病变和生长抑制,而正常细胞未出现病变现象,表明目的病毒具有较高的安全性和对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。此外ZD55-KAL感染肝癌细胞后引起凋亡,所携带的治疗基因KAL能通过促进肿瘤的凋亡达到抑制肿瘤细胞生长的效果。     

RNA干扰抑制COX-2的重组腺病毒的构建及体外抗肿瘤活性

环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是肿瘤治疗中的一个重要的靶向基因。可COX-2抑制剂因易引发肝损伤的副作用,影响了COX-2抑制剂在临床上的应用。本研究构建出运载小干扰RNA的重组腺病毒试图解决上述难题。实验结果显示:癌细胞系中的COX-2成功被抑制,同时活细胞计数实验结果表明COX-2在癌细胞中的抑制能促使癌细胞生长受到抑制,而正常细胞不受到影响,证明该载体系统能有效解决COX-2抑制剂易引发肝损伤的毒副作用,为其临床应用提供了坚实的基础。     

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞.为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果.结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应.说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统.     

增殖腺病毒SG600-IL24与非增殖腺病毒Ad-IL24的抗肿瘤效果比较

利用DNA克隆和重组技术,构建增殖腺病毒SG600-IL24.ELISA检测比较SG600-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24分别感染肝癌细胞BEL-7402、Hep3B、HepGⅡ、SK-Hep-1和成纤维细胞BJ细胞后IL24的表达量,表明SG600-IL24病毒能在肿瘤细胞内大量表达IL-24,最高可达773 ng/mL(MOI=1),且在多数肿瘤细胞内IL24表达量显著高于Ad-IL24,而在正常细胞内表达量与Ad-IL24基本相同.半数组织感染剂量(TCID50)法检测SG600-IL24 48 h和96 h的增殖情况,发现SG600-IL24可在上述4种肿瘤细胞内大量增殖,96 h的最高增殖倍数可达到246153.MTT法和CPE法对比SG600-IL24和Ad IL24对不同细胞的杀伤作用结果显示上述4种肿瘤细胞SG600-IL24对上述4种肿瘤细胞的50%杀伤剂量(IC50)和90%杀伤剂量(IC90)均明显低于Ad-IL24.以上结果表明SG600-IL24体现了病毒治疗与基因治疗的双重抗肿瘤用,其效果明显好于Ad-IL24,为该病毒治疗肝癌的体内研究打下基础.     

增殖腺病毒SG600-IL24与非增殖腺病毒Ad-IL24的抗肿瘤效果比较

利用DNA克隆和重组技术,构建增殖腺病毒SG600-IL24。ELISA检测比较SG600-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24分别感染肝癌细胞BEL-7402、Hep3B、HepGⅡ、SK-Hep-1和成纤维细胞BJ细胞后IL24的表达量,表明SG600-IL24病毒能在肿瘤细胞内大量表达IL-24,最高可达773 ng/mL（MOI=1）,且在多数肿瘤细胞内IL24表达量显著高于Ad-IL24,而在正常细胞内表达量与Ad-IL24基本相同。半数组织感染剂量（TCID50）法检测SG600-IL24 48 h和96 h的增殖情况,发现SG600-IL24可在上述4种肿瘤细胞内大量增殖,96 h的最高增殖倍数可达到246153。MTT法和CPE法对比SG600-IL24和Ad-IL24对不同细胞的杀伤作用结果显示上述4种肿瘤细胞SG600-IL24对上述4种肿瘤细胞的50%杀伤剂量（IC50）和90%杀伤剂量（IC90）均明显低于Ad-IL24。以上结果表明SG600-IL24体现了病毒治疗与基因治疗的双重抗肿瘤用,其效果明显好于Ad-IL24,为该病毒治疗肝癌的体内研究打下基础。     

携带miR-34a重组腺病毒的构建及其体外表达研究

为了克服目前普遍采用的直接加入成熟体的MicroRNA治疗肿瘤方法所存在的弊端,本研究构建了携带miR-34a的重组腺病毒。该腺病毒不但缺失基因组的E1及E3区而不具备复制能力,而且利用RNA转录酶II启动子调控miR-34a表达。实验通过qRT-PCR技术检测BEL7404细胞内miR-34a表达量,结果表明:携带miR-34a重组腺病毒能够在肿瘤细胞中特异性表达外源MicroRNA。这一技术的建立为肿瘤的基因治疗开拓了一条新路,并为MicroRNA的研究提供一个新方法。     

增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24体外杀伤肝癌细胞的研究

研究溶瘤腺病毒SG511携带由热激蛋白70(hsp70)启动子调控IL-24构成的增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24对人肝癌细胞株的体外杀伤效果.实验采用ELISA法检测不同MOI值感染肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B细胞3 d后IL-24的表达;MTT法检测SG511、Ad11-IL24以及SG511-pHSP70-IL24对肝癌细胞株SMMC-7721、Hep3B以及人正常成纤维细胞株MRC-5及BJ增殖的抑制作用;并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况.ELISA检测到SG511-pHSP70-IL24感染SMMC-7721和Hep3B细胞后,IL-24有明显表达;MTT实验结果表明SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.同时结晶紫实验也证明了SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24相比腺病毒Ad11-IL24以及SG511,对肝癌细胞有较明显的生长抑制和凋亡诱导作用.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

GSK-3抑制剂增强携带TRAIL的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

研究携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒联合化疗药物GSK-3抑制剂(氯化锂和SB-415286)对人肝癌细胞的体外杀伤作用.采用MTT法检测病毒ZD55-TRAIL联合化疗药物氯化锂和SB-415286对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404以及正常细胞株L02、QSG-7701增殖的抑制作用,并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药的杀伤作用和安全性;利用Hoechst33342染色对肝癌细胞株BEL-7404的细胞凋亡进行形态学观察;通过Western blot检测肝癌细胞HepG-2细胞凋亡信号通路的变化.结果表明:低剂量的氯化锂和SB-415286能显著提高ZD55-TRAIL对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404的杀伤作用,对人体肝正常细胞株L02、QSG-7701无明显的抑制作用.说明GSK-3抑制剂能够解除肝癌细胞对TRAIL的抗性,增强携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤.