A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病菌（FMDV）（L1-L5）的RNA，用1对通用引物经RT-PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段，克隆后通过测序获得其核苷酸序列，分析表明，除L2株外，其余4株（L1，L3，L4和L5）VP1基因的核苷酸序列同源性在96.7%-99.8%。氨基酸序列同源性在99.5%-100%；而L2株与L1，L3，L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82.0%-83.4%，氨基酸序列同源性在89.7%-90.1%,L1,L3,L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86，HKN/1/99，HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在85.0%-99.8%，属于同一基因型；而与L2，F29/CHINA及国外大多数毒株相比，属于不同的基因型，其核苷酸序列同源性仅为41.0%-82.6%，5株毒株中的L1，L3，L4和L5的主要中和抗原位点140-160，200-213位氨基酸序列完全相同，推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性。     

C型口蹄疫病毒VPI基因的克隆及真核表达载体的构建

应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。     

鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52毒株的尿囊液浓缩,用TRIzol 试剂抽提病毒RNA作为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,参照已发表的IBV-Beaudette 株S基因序列,设计并合成一对特异性引物,扩增得到长度约3.6 kb 的S基因片段,利用引物设计中EcoR I和BamH I 酶切位点插入到克隆载体pBlueScript SK 的多克隆位点中,转化感受态E.coli DH5α.经酶切分析和PCR等方法鉴定,筛选出阳性克隆,进行核苷酸序列测定,证实获得了S 基因的全长序列.利用DNAstar等分析软件与GenBank中其它IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析,结果表明,H52毒株与已报道的核苷酸的同源性在83.45%～99.71%之间,氨基酸的同源性在82.10%～99.26%之间.     

猪O型口蹄疫病毒温度敏感突变株部分基因的PCR扩增及序列分析

根据O型FMDV全基因组序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因,并对猪O型FMDV的强弱毒株基因进行克隆与序列分析。结果表明:扩增得到的O型口蹄疫病毒温度敏感株L、P1、P2、P3(3C、3D)区目的基因片段大小分别为603、2 208、1 464、639、1 410 bp,与预期相符。各区序列拼接后与野生型猪O型FMDV序列比对,两者同源性为88%。     

口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析

应用RT PCR和nPCR实现了口蹄疫病毒O/PanAsia/10株的全衣壳基因的克隆和序列测定.对核苷酸和氨基酸的序列分析表明,与经典O型毒株比较存在较大变异.其中4种结构蛋白的变异顺序是VP1>VP3>VP2>VP4.P1基因G+C值约55%.全衣壳蛋白相对分子质量约8 0×104.主要结构蛋白VP1呈碱性,等电点约9 5.     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析

应用分子生物学技术,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞9F12中提取总RNA,经反转录,PCR扩增及克隆,得到VL基因。序列测定结果表明,9F12的VL基因为336 bp,可编码112个氨基酸。用NCBI GenBank分析表明,VL基因符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系,9F12的VL基因片段隶属于抗体κ轻链20家族。9F12的VL基因的克隆为抗O型口蹄疫病毒单链抗体的构建与表达奠定了基础。     

口蹄疫病毒 VP1与3ABC 基因片段的克隆及表达

根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV) VP1和3ABC 基因序列,设计了2对引物. 采用RT-PCR方法从FMDV分离株O/HK/2001扩增得到 VP1和3ABC 基因. 经对它们的核苷酸序列测序和同源性比较,显示与14株O型FMDV参考毒株中的O/HKN/2002同源性最高(分别为98.3%和98.6%),并且在 VP1决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定族的144、148、154和208位     

A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病.为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体PI-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C.将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2048.结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达.     

广东地区口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析

【目的】了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)的遗传变异情况,为我国FMDV流行病学的研究及防控提供基础数据。【方法】对2015—2016年间收集的广东地区猪的病料进行FMDV VP1和3A基因的扩增测序和序列分析。【结果】11株O型FMDV均属耿马谱系毒株,7株A型FMDV均属Asia型毒株。11株O型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,GD-MM-3株与O/BY/CHA/2010株序列相似性最高,为95.3%;GD-1株、GD-MM-1株和GD-MM-3株与O/MYA/1/98株序列相似性最高,为90.8%。7株A型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株序列相似性最高,为99.8%;A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株序列相似性最高,为91.4%。11株O型FMDV的3A蛋白不存在氨基酸的缺失,7株A型FMDV的3A蛋白存在较多氨基酸的缺失。【结论】广东部分地区FMDV基因型复杂,预防控制困难。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.     

口蹄疫病毒Akesu/58持续感染分离株P1基因的克隆及序列分析

以持续感染模型动物牦牛的食道/咽部分离物(O/P液)为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了P1结构蛋白基因的全序列。序列测定和分析结果表明,持续感染分离株的序列与Akesu/58参考毒株的序列相比,其同源性为86.5 %,而与china/99的同源性高达89.4 %。氨基酸差异分析表明,氨基酸相应的密码子中T-C或A-G互变频率较高,这可能是导致氨基酸改变的主要因素。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％．     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

15株猪流行性腹泻病毒河南株ORF3全基因的克隆与序列分析

为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。