HSV-TK/GCV与5-FU/DDP联合治疗舌鳞癌移植瘤的研究

本研究尝试联合自杀基因治疗与化疗来提高舌癌的疗效 ,采用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV TK) /丙氧鸟苷(GCV)自杀基因治疗与化疗药物 [5 FU和 (或 )DDP]联合 ,通过动物实验探讨两者联合应用提高舌癌疗效的可能性。1 材料和方法 :于BALB/c裸小鼠右侧腋下接种Tca8113细胞 ,肿瘤形成直径约 4mm时 (第 7天 )随机分组如下 :①空白组 ;②HSV TK/GCV组 ;③氟尿嘧啶 (5 FU)组 ;④ 5 FU HSV TK/GCV组 ;⑤顺铂 (DDP)组 ;⑥DDP HSV TK/GCV组 ;⑦DDP 5 FU组 ;⑧DDP 5 FU HSV TK/GCV组 ;每组 6只。接种第 8天瘤内…     

8-Br-cAMP提高HSV-TK/GCV自杀基因系统旁观者效应的研究

目的 探讨8-Br-cAMP对单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）/丙氧鸟苷（GCV）系统旁观者效应的增强作用及机理。方法 应用FCM、透射电镜检测8-Br-cAMP对口腔鳞癌细胞（Tca8113）、间隙连接蛋白43（Cx43）及间隙连接的诱导分化作用;采用析因分析法分析8-Br-cAMP对HSV-TK/GCV系统旁观者效应的影响。结果 口腔鳞癌细胞经 10-4mol/L 8-Br-CAMP处理后:FCM检测显示 Cx43表达阳性的细胞由治疗前的（4.8 ± 0.26）％上升到（21.3±0.65）％,两组比较P<0.001;透射电镜显示细胞超微结构出现分化,细胞间出现间隙连接;MTT检测显示增强了HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应,两者间存在协同关系。结论8-Br-cAMP可诱导分化口腔鳞癌细胞并显著提高HSV-TK/GCV系统治疗时的旁观者效应。     

hTR反义寡核苷酸联合全反式维甲酸的体内抗口腔鳞癌作用研究

目的：评价人端粒酶RNA模板（hRT）反义寡核苷酸联合全反式维甲酸的体内抑瘤效果,并对其作用机制进行初步探讨。方法：裸鼠皮下注射Tca8113细胞,建立荷瘤动物模型。分别给予端粒酶反义寡核苷酸、端粒酶正义寡核苷酸、全反式维甲酸、端粒酶反义寡核苷酸联合全反式维甲酸、端粒酶正义寡核苷酸联合全反式维甲酸治疗。治疗结束时,计算各处理组抑瘤效果。端粒酶重复序列扩增法（TRAP法）检测各实验组肿瘤端粒酶活性;Tunel法检测细胞凋亡水平;免疫组织化学法观察bcl-2和bax蛋白表达情况;透射电镜检测各实验组细胞超微结构。实验结果以SPSS10.0软件包进行单因素、双因素方差分析。结果：端粒酶反义寡核苷酸和全反式维甲酸治疗均可抑制肿瘤的生长,两者联合应用具有协同作用。治疗后组织标本与对照组比较,端粒酶活性明显下降、细胞凋亡数目增高,bcl-2蛋白表达下调（P〈0.05）。结论：针对端粒酶hTR靶点的端粒酶反义寡核苷酸联合全反式维甲酸治疗,对荷瘤鼠具有协同抑制肿瘤生长的作用。其抑瘤作用机制可能是通过降低端粒酶活性而引起肿瘤细胞凋亡,bcl-2在此过程中起着重要作用。     

全反式维甲酸联合阿帕替尼抑制口腔鳞癌细胞增殖体外研究

目的:观察和分析全反式维甲酸(ATRA)联合阿帕替尼对口腔鳞癌细胞的增殖抑制作用.方法:实验分为对照组、ATRA组、阿帕替尼组及联合用药组,利用MTT法检测ATRA联合阿帕替尼对口腔鳞癌细胞CAL27及HN4增殖的影响;倒置显微镜观察两药联用对口腔鳞癌细胞形态的影响;利用实时定量RT-PCR法检测肿瘤细胞角蛋白KRT1...     

全反式维甲酸对舌癌细胞株抗增殖作用的研究

目的：研究全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）对舌癌细胞株的体外抗增殖作用。方法：经不同浓度全反式维甲酸（１０＾－７￣１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ）处理舌癌细胞株后,应用流式细胞仪检测舌癌细胞细胞周期变化。结果：舌癌细胞株经１０＾－７￣１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ全反式维甲酸处理１￣６ｄ后,Ｇ１／Ｇ０期比率呈上升趋势,Ｓ期和Ｇ２＋Ｍ期比率呈下降趋势,与对照组相比,经全反式到处理３ｄ和６ｄ的细胞,其Ｇ１／Ｇ０期比率明显上升（Ｐ     

全反式维甲酸对涎腺样囊性癌细胞株Acc—M体外抗增殖作用的研究

目的 维甲酸类化合物能预防头颈部癌前病变转变为癌，并能有效地降低头颈部第二原发癌的发生率。近来研究证实，维甲酸对头颈部鳞癌有诱导分化治疗作用，但维甲酸对头颈部腺癌诱导分化作用研究少见报道。方法 本研究采用克隆形成法、ＭＴＴ检测法以及细胞周期技术，把全反式维甲酸对人涎腺腺样囊性癌细胞株的体外抗增殖作用周期进行了观察。结果显示，ＡＴＲＡ对Ａｃｃ－Ｍ细胞有一定抗增殖作用，且该作用与浓度、时间、呈依赖关系     

C-Myc/Fas基因舌鳞癌移植瘤内转染的抑瘤效应研究

近来发现 ,营养不足时 ,C myc过表达也可介导细胞凋亡。而且C myc介导凋亡主要通过上调Fas表达发挥作用。鉴于C myc凋亡机制与Fas蛋白的特殊关系 ,C myc在口腔鳞癌中过表达的普遍性 ,以及晚期肿瘤中部的缺血环境 ,我们采用基因转染技术 ,探讨C myc/Fas瘤内转染的抑瘤效应。1.材料和方法 :(1)材料 :真核表达质粒 pBK Fas、pcDNA3 C myc;β actin上游引物 5′ CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC 3′,下游 5′ GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA 3′ ;Fas上游引物5′ AGCTCTTTCACTTCGGAGGATT 3′,下游 5′ TGGCAAAA GAAG…     

HSV-TK自杀基因对涎腺多形性腺瘤细胞治疗的实验研究

目的研究单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)／丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)系统对人涎腺多形性腺瘤体外基因治疗的作用。方法采用腺病毒包装重组脂质体介导的含有HSV-TK全长的cDNA真核表达质粒PDC312-HSVTK转染人涎腺多形性腺瘤细胞，通过RT-PCR检测TK基因在转染细胞中的表达；用MTT法检测HSV-TK／GCV系统对多形性腺瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应：采用倒置显微镜、组织学染色等观察HSV-TK／GCV系统作用细胞后的形态学改变。结果HSV-TK基因转染24小时后，肿瘤细胞开始出现空泡性变；转染48小时后，RT-PCR从转染的细胞中成功扩增出1150bp的特异性TK基因片段。转染36小时后加入不同浓度的GCV治疗，细胞出现核固缩，胞浆裂解，随之细胞死亡、脱壁的现象。细胞存活率随HSV-TK／GCV作用时间延长而逐渐下降，当加入10^-4mol／LGCV治疗7天时，HSV-TK／GCV系统的杀伤作用最强，细胞存活率为10．3％。当TK阳性的细胞占细胞总数50％时，其旁观者效应最明显，细胞存活率为31．7％。结论HSV-TK／GCV系统对涎腺多形性腺瘤细胞具有明显的杀伤作用和旁观者效应。     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统治疗腺样囊性癌的体外实验研究

目的　体外观察腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及羟基无环鸟苷系统 (ADV -HSV -Tk/GCV)对人腺样囊性癌细胞 (ACC -2及ACC -M )的杀伤作用。方法　分别将人腺样囊性癌细胞株 (ACC -2及ACC -M )用腺病毒构建的绿色荧光蛋白按 1∶10 ,1∶2 0 ,1∶3 0转染 ,在 12～ 3 6h内用荧光显微镜观察细胞的转染率。MTT法观察ADV -HSV -TK在不同感染复数 (5～ 60 )以及不同浓度GCV处理时对ACC -2及ACC -M的细胞杀伤作用以及“旁观者效应”。结果　体外研究发现 ,ACC -2及ACC -M均能被腺病毒 -绿色荧光蛋白转染。最小感染复数为 10～ 2 0 ,转染率与感染复数呈正相关。在感染复数为 5 ,GCV浓度为 2 5 μg/ml时 ,能够发挥细胞杀伤效应且出现剂量依赖性。MTT法检测发现经ADV -HSV -TK处理后 ,当GCV浓度为 2 5 μg/ml或高于该浓度时ACC -2及ACC -M的细胞抑制率为 40 % -60 % ,而当GCV单独作用时则无此作用。转染ADV -HSV -TK的细胞与未转染细胞按不同比例混合提示“旁观者效应”的存在 ,且转染细胞的比例越高 ,被杀伤的细胞比例越大。结论　腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及羟基无环鸟苷系统 (ADV -HSV -TK/GCV)在体外能够有效抑制腺样囊性癌细胞 ,然而 ,其细胞杀伤效应及“旁观者效应”仍有待提高     

全反式维甲酸对涎腺腺样囊性癌细胞株Acc-M体外抗增殖作用的研究

目的维甲酸类化合物能预防头颈部癌前病变转变为癌，并能有效地降低头颈部第二原发癌的发生率。近来研究证实，维甲酸对头颈部鳞癌有诱导分化治疗作用，但维甲酸对头颈部腺癌诱导分化作用研究少见报道。方法本研究采用克隆形成法、ＭＴＴ检测法以及细胞周期测定技术，把全反式维甲酸（ａｌｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄＡ－ＴＲＡ）对人涎腺腺样囊性癌细胞株（ＡｃｃＭ）的体外抗增殖作用和细胞增殖周期进行了观察。结果显示，ＡＴＲＡ对ＡｃｃＭ细胞有一定抗增殖作用，且该作用与浓度、时间呈依赖关系；ＡｃｃＭ细胞经ＡＴＲＡ作用７２小时后其Ｓ期比例明显下降，同时Ｇ０＋Ｇ１期比例上升。结论研究表明，５～２０μｍｏｌ／Ｌ浓度的ＡＴＲＡ对ＡｃｃＭ细胞产生抗增殖作用。     

维甲酸对人舌鳞癌细胞株Tca83 Fas/FasL基因表达的影响

目的探讨不同浓度全反式维甲酸（all-transretinoidacid,简称RA）,在不同作用时间下对人舌鳞癌细胞株Tca83诱导凋亡过程中,相关凋亡基因Fas/FasL的表达及两者之间可能的关系。方法采用TUNEL法检测RA作用下细胞发生凋亡的情况;应用RT-PCR和细胞免疫组化方法检测药物作用组和对照组细胞Fas蛋白水平和mRNA水平的表达。结果TUNEL法显示生理药物浓度1-10uRA作用到第5d时可见明显的凋亡细胞出现,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。相应的RT-PCR亦显示RA作用到5d时FasmRNA水平明显提高,而细胞的FasLmRNA水平却没有改变。细胞免疫组化结果也显示RA可增强Fas抗原的表达。结论RA能诱导Tca83的凋亡基因Fas的表达。提示临床上可利用RA作为先期诱导药或与增强Fas表达的药物、抗Fas抗体联合应用,以增强RA药效,降低不良反应。     

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统治疗舌癌的实验研究

目的　探讨腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpessimplexvirusthymidinekinase,HSV TK) /丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)自杀基因系统对舌鳞癌细胞系的治疗作用。方法　RT PCR检测重组腺病毒感染Tca8113舌鳞癌细胞系后TK基因的表达情况 ;MTT法检测HSV TK/GCV系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果　AdCMVHSV TK可在舌癌细胞中表达TK基因并具有高转染率 ;HSV TK/GCV系统对舌癌细胞具有杀伤作用 ,杀伤呈时间和剂量依赖性 ;但该系统的旁观者效应差。结论　HSV TK/GCV自杀基因系统对舌鳞癌细胞系具有一定的杀伤作用     

半导体量子点对舌鳞状细胞癌Tca8113系生物学行为影响的研究

目的：研究新型发光纳米材料半导体量子点（semiconductor quantumdots，QD）对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113生物学行为的影响。方法：用不同浓度最大发射波长为605nm的QD与Tca8113共培养，观察QD对Tca8113细胞生长的影响。用QD标记Tca8113细胞（Tca8113-QD），利用transwell小室法和冲刷实验，观察Tca8113-QD细胞侵袭、黏附和趋化运动能力的变化。结果：Tca8113细胞与不同浓度QD共培养后，其细胞的生长曲线基本一致，差异无统计学意义。Tca8113-QD细胞和Tca8113细胞的侵袭、黏附和趋化运动能力差异无统计学意义。结论：用QD标记Tca8113细胞后，不影响肿瘤细胞生长、侵袭和转移能力，为半导体量子点在活体生理条件下用于肿瘤细胞和细胞内分子成像及示踪研究提供了科学依据。     

塞来昔布增强博来霉素对人舌鳞状细胞癌Tca8113杀伤作用的研究

目的 研究环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)增强博来霉素(bleomycin)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的杀伤作用.方法 用含不同浓度的塞来昔布和博来霉素培养液培养Tca8113细胞24、48、72 h后,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞生长抑制率,并采用金正钧法判断药物合用的相互作用;流式细胞术检测Tca8113细胞周期进程和诱导细胞凋亡的作用.结果 小剂量的塞来昔布(10 μmol/L)可增强博来霉素对Tca8113细胞的生长抑制作用,增强博来霉素阻滞Tca8113细胞周期进程的作用,其阻滞G1期细胞进入S期的作用最为明显,导致G0、G1细胞的数量增加[(60.93±0.32)%],S期[(30.57±0.78)%]、G2及M期[(8.50±0.50)%]细胞减少,同时,细胞凋亡率[(1.87±0.11)%]显著提高.结论 小剂量的塞来昔布可增强博来霉素对Tca8113细胞的毒性作用,阻滞细胞周期进程并诱导细胞凋亡.     

树状细胞疫苗抑制肿瘤的实验观察

目的观察经肿瘤抗原致敏的树状细胞（DC）疫苗对荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（rhTNF-α）协同诱导人外周血单核细胞成为DC。Tea8113舌癌细胞可溶性抗原体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），共同接种至荷瘤裸鼠体内行免疫治疗。结果人外周血单核细胞在细胞因子协同诱导下可获得功能正常的DC，用致敏DC＋CTLs免疫治疗的荷瘤裸鼠与其他实验组相比，明显抑制肿瘤生长，肿瘤倍增时间显著提高（P〈0．05）。结论从人外周血来源的单核细胞在多种细胞因子作用下可诱导为功能正常的DC、冻融抗原体外致敏的DC，经其激活的肿瘤特异性CTLs对荷舌鳞癌裸鼠有明显的免疫治疗作用，可望成为口腔颌面部舌癌免疫治疗的新途径。     

舌鳞癌无区域性淋巴结转移患者的颈部处理

目的 评价对于舌鳞癌无区域性淋巴结转移患者造反性颈淋巴清扫的必要性。方法对１３０例舌癌颈淋巴结临床阴性的患者用Ｃｏｘ回归模型（Ｃｏｘ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｒ,Ｃｏｘ模型）多因素分析方法,分析了影响颈部转移的因素,同时比较颈部淋马清扫与否两组的生存效果。结果 原发灶Ｔ分级、治疗方法及放疗与颈淋巴结复发有明显相关意义,是否颈淋巴清扫及其他几个因素则与复发无关,其生存率表明差异无显著性,生存率     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.     

人内皮抑素基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生长的影响

目的 探讨人内皮抑素(hES)基因导入舌鳞癌Tca8113细胞后的表达情况及其抑制肿瘤生长效应。方法 以脂质体为载体将hES基因导入Tca8113细胞,通过动物实验观察转基因Tca8113细胞移植瘤生长情况,免疫组织化学检测肿瘤组织中hES及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,Weidner法行肿瘤微血管密度(MVD)计数,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果 移植瘤生长第27天,实验组肿瘤组织中hES的表达率高于对照组(P<0.01);VEGF的表达率低于对照组(P<0.01)。实验组MVD计数低于对照组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡率则明显高于对照组(P<0.01)。hES基因转染对肿瘤生长的抑制率78.9％。结论 hES基因转染舌鳞癌细胞可体内诱导hES蛋白高效表达并具有抑制移植瘤生长的效应。     

血管内皮生长因子C 对舌鳞癌癌周淋巴管的促增殖作用

目的研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)对舌鳞癌癌周淋巴管的促增殖作用.方法将VEGF-C高表达的舌鳞癌细胞株(A组)接种于发育至第6～8天的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM),设立空白质粒转染组(B组)和空白对照组(C组),5′-核苷酸酶(5′-Nase)染色观察瘤周淋巴管,淋巴管形态学测量统计分析淋巴管数密度(LVD)、截面面积以及周长的变化.结果 3组在CAM上均能成瘤,肿瘤组织对周围CAM的侵袭较弱,瘤体组织内未见淋巴管的生成;瘤周淋巴管形态学测量分析发现A组癌周淋巴管的LVD、截面面积和周长均高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.01);B、C组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 CAM是研究淋巴管的较理想的模型;VEGF-C能够诱导癌周淋巴管扩张,这可能是VEGF-C增加舌鳞癌颈淋巴转移的机制之一.