蚯蚓金属硫蛋白定量PCR检测方法及其分子诊断

根据GenBank中蚯蚓(Eisenia fetida)金属硫蛋白(MT)基因序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出目的基因片段,将目的基因片段插入pEASY-Blunt中制备质粒标准品.通过不同梯度稀释倍数的质粒标准品,建立了目的基因MT与内参基因β-actin的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法.通过土壤染毒培养实验,将蚯蚓分别暴露于50,500,1000mg/kg 重金属Cd染毒的自然土壤中培养14,28d,研究蚯蚓体内MT mRNA转录水平的表达变化.结果表明,重组质粒测序后显示目的片段序列同源性好,证明所设计的MT、β-actin引物能成功用于蚯蚓MT mRNA的检测.两基因构建的荧光定量标准曲线线性关系分别为0.994,0.999,且PCR扩增效率也皆接近于100%.染毒实验发现,Cd可诱导蚯蚓体内MT mRNA的表达,其表达水平与Cd污染暴露呈现出剂量-效应和时间-效应关系,表明蚯蚓MT基因可作为潜在分子标志物,诊断环境中Cd污染及其暴露水平.     

多环麝香污染胁迫对蚯蚓特异性蛋白基因表达的影响

为了探讨蚯蚓特异性蛋白基因表达在监测多环麝香低水平长期暴露污染中的应用,选择蚯蚓热休克蛋白(HSP70)、钙网蛋白(CRT)、亲环素A(cyPA)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)等代表性蛋白基因作为供试基因.采用自然土壤污染模拟实验,基于mRNA表达分子水平,研究吐纳麝香(AHTN)与佳乐麝香(HHCB)长期(28 d)污染胁迫对以上各特异性蛋白基因响应表达的影响.通过序列同源性比较与荧光定量PCR熔解曲线结果分析,表明设计的引物适合供试基因mRNA表达水平的检测.染毒暴露28 d后,当AHTN染毒浓度小于30μg.g-1或HHCB浓度小于50μg.g-1时,蚯蚓HSP70基因表达水平无显著变化,而AHTN浓度等于或大于30μg.g-1和HHCB浓度等于或大于50μg.g-1时,HSP70基因表达水平呈显著下调趋势;而各AHTN或HHCB浓度处理组中蚯蚓CRT基因显著上调表达;cyPA和TCTP基因表达水平与对照组比较均无呈现显著性差异.研究结果表明,HSP70与CRT等基因的响应表达有望成为表征多环麝香土壤污染暴露水平及生态毒理效应的潜在生物标志物.     

金属硫蛋白的测定

1957年,Margoshes等首先在马的肾皮质中发现了一种镉含量很高的低分子蛋白质。后来,Kagi和Vallee进一步提纯了这种蛋白质,并发现其中硫的含量特别高,加之含有金属,故称为金属硫蛋白(Metallothioneins.MT)。镉中毒时,一旦出现肾小管损害,MT则从尿     

Cu暴露条件下翡翠贻贝(Perna viridis)消化腺内金属和类金属硫蛋白的变化

通过室内急性暴露实验研究了翡翠贻贝(Perna viridis)消化腺富集Cu及其MTLP(metallothionein like protein)水平随时间的变化规律.结果表明,2种Cu浓度暴露条件下(12.7μg/L和63.5 μg/L),贻贝消化腺内Cu的平均吸收速率分别为2.045和7.028μg/·(g·d)-1,富集系数分别为2 074和1 619.实验测定了所有样本的溶解态Cu与总Cu含量,2个暴露组二者的比值随时间呈现出不同的变化趋势,低浓度组先降低随后上升到与对照样本几乎相同的水平,而高浓度组一直呈下降趋势,表明不同污染程度生物体内金属消化机制进程存在差异.利用Brdicka极谱法测定了贻贝消化腺内MTLP的含量,对照组贻贝消化腺的MTLP平均含量为(0.551±0.037)mg/g;12.7 μg/L Cu暴露组MTLP含量随时间的变化范围是0.407～0.699 mg/g,而63.5 μg/L Cu暴露组在暴露初始MTLP水平就显著增加(p＜0.001),变化范围由初始0.942 mg/g降至0.826 mg/g.分析结果表明贻贝消化腺内的MTLP水平随着水体及生物体内的金属含量升高而增加,并与体内Cu浓度成明显的负指数增长关系(p＜0.0001).     

Cu暴露条件下翡翠贻贝（Perna viridis）消化腺内金属和类金属硫蛋白的变化

通过室内急性暴露实验研究了翡翠贻贝（Perna viridis）消化腺富集Cu及其MTLP （metallothionein like protein）水平随时间的变化规律.结果表明,2种Cu浓度暴露条件下（12.7 μg/L和63.5 μg/L）,贻贝消化腺内Cu的平均吸收速率分别为2.045和7.028 μg·（g·d）^-1,富集系数分别为2 074和1 619.实验测定了所有样本的溶解态Cu与总Cu含量,2个暴露组二者的比值随时间呈现出不同的变化趋势,低浓度组先降低随后上升到与对照样本几乎相同的水平,而高浓度组一直呈下降趋势,表明不同污染程度生物体内金属消化机制进程存在差异.利用Brdicka极谱法测定了贻贝消化腺内MTLP的含量,对照组贻贝消化腺的MTLP平均含量为（0.551±0.037）mg/g;12.7 μg/L Cu暴露组MTLP含量随时间的变化范围是0.407～0.699 mg/g,而63.5 μg/L Cu暴露组在暴露初始MTLP水平就显著增加（p<0.001）,变化范围由初始0.942 mg/g降至0.826 mg/g.分析结果表明贻贝消化腺内的MTLP水平随着水体及生物体内的金属含量升高而增加,并与体内Cu浓度成明显的负指数增长关系（p<0.000 1）.     

锰胁迫下龙葵和小飞蓬根叶中植物螯合肽和类金属硫蛋白的变化

采用溶液培养的方式研究不同锰浓度(0.005,2,4,8,16mmo.lL-1)胁迫下龙葵和小飞蓬的根和叶中的植物螯合肽(PCs)和类金属硫蛋白(MTLP)的诱导合成量.结果显示,随着锰浓度的升高,两种植物的株高和根长先略高于对照,而后逐渐下降.锰胁迫诱导植物产生的PCs有先上升后下降的趋势,但含量较少;而PCs产生的前体物质谷胱甘肽(GSH)和MTLP的诱导量与锰浓度之间存在一定相关性,随着锰浓度增加呈现先上升后下降的规律.两者的非蛋白巯基化合物(TNP-SH)和GSH在8mmol·L-1锰浓度下达到最大值,总体上龙葵的含量比小飞蓬大.MTLP的含量随着锰浓度的升高呈先上升后下降的趋势,龙葵在8mmol·L-1锰浓度时含量最高,而小飞蓬叶和根分别在2mmol·L-1和4mmo.lL-1时即达到最大,之后下降,且龙葵的MTLP含量大于相应浓度下的小飞蓬的含量.实验表明GSH和MTLP对不同锰处理浓度的响应都较敏感,故可作为植物耐锰胁迫及鉴定土壤锰污染的参考指标.随着Mn处理浓度增大,龙葵受Mn胁迫的影响比小飞蓬小,说明其耐Mn水平较小飞蓬高,更适合用于Mn污染地区的植物修复.     

褐菖鮋（Sebastiscusmarmoratus）金属硫蛋白的分离提纯及免疫测定

通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换柱层析，从褐菖的肝脏分离金属硫蛋白，经氨基区组成分析表明：褐菖的金属硫蛋白不含环状氨基酸，半胱氨酸含量达３５％，估算分子量为６７００道尔顿。等电聚焦显示两条区带，ＰＩ分别为４．０和４．２。金属硫蛋白经与牛血清蛋白交联对兔进行免疫，兔抗血清用ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化并标记上辣根过氧化物酶，利用酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）对褐菖金属硫蛋白进行分析，测定范围为５—１００ｎｇ／ｍＬ，经诱导和没诱导的肝提取液金属硫蛋白含量分别为４５０μｇ／ｍＬ和２０μｇ／ｍＬ，两者之间差别为２０多倍。     

华溪蟹功能性重组金属硫蛋白的表达及抗血清制备

采用SUMO融合表达系统表达河南华溪蟹金属硫蛋白(Metallothionein,MT),经Ni离子螯合柱分离纯化后,用SDS-PAGE、紫外光谱扫描鉴定,并对重组MT的金属结合及清除自由基能力进行了检测.同时,利用纯化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c小鼠制备抗血清,间接ELISA检测该抗血清的效价,Western blot和免疫组化染色检测其特异性.结果表明,河南华溪蟹MT以可溶形式获得表达,经金属螯合层析纯化后分析仍具有金属结合特性和清除羟自由基的生物学功能.免疫BALB/c小鼠后获得特异性的抗MT抗血清,该抗血清具有较高的效价和良好的特异性,可识别组织MT,用于免疫组化分析.     

转枣树金属硫蛋白基因拟南芥对镉的耐受性研究

对转枣树金属硫蛋白(MT)基因拟南芥植株与非转基因对照组拟南芥对重金属镉的耐受性进行了研究,为实现用转基因生物法治理环境中重金属污染提供依据。采用水培实验,比较了转基因拟南芥与对照组拟南芥对镉的吸收情况。实验表明:经0.1 mol/L镉处理24 h和48 h时,转枣树MT基因拟南芥根部对镉的吸收量分别为22,323 mg/L,地上部分为513,667 mg/L,明显超过对照组(根部93,107 mg/L;地上部分323,437 mg/L);0.001 mol/L镉浓度处理下,转MT基因拟南芥对镉的富集系数为92.0%,而对照组仅为47.3%;转枣树MT基因拟南芥对镉的转移系数为1.053~3.473,因此转MT基因拟南芥属于镉超富集植物,转枣树MT基因显著地提高了拟南芥对重金属镉的耐受性。     

以梭鱼金属硫蛋白基因表达监测海洋重金属污染

分离了梭鱼金属硫蛋白132个碱基对应44个氨基酸的部分基因序列,以此为基础建立了分析梭鱼金属硫蛋白基因表达的实时定量PCR方法,并用于分析渤海南戴河和大神堂近岸海域野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达.结果表明,南戴河野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达水平(雄鱼:0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin)明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平(雄鱼:0.0017± 0.0011 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin).该结果与两地野生梭鱼体内重金属残留水平相一致,提示梭鱼金属硫蛋白基因可作为监测海洋重金属污染的敏感标志物之一.     

类二 多氯联苯对赤子爱胜蚓生理活性的影响

通过人工土壤法,研究0.1, 1, 10, 100, 1000μg/kg类二 多氯联苯暴露浓度对赤子爱胜蚓 (Eisenia fetida)抗氧化酶(SOD酶、CAT酶和GST酶)、抗氧化分子(GSH)、氧化损伤物(MDA)等生理活性指标在第2, 7, 14, 28d时的影响.结果显示,类二 多氯联苯刺激赤子爱胜蚓生理活性显著增加(P<0.05),可诱导蚯蚓抗氧化系统应答启动;不同暴露时间下,受试物浓度与蚯蚓生理活性的相关性分析显示,蚯蚓不同生理活性指标对受试物的最佳响应时间不同, Cu-Zn SOD响应最早(7d), SOD, CAT, GSH, MDA次之(14d), GST响应最迟(28d);在最佳响应时间下,受试物暴露浓度对数与生理活性值对数均存在显著的剂量-效应关系(P <0.001)     

土壤甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓及小麦的毒性效应

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)和小麦(Triticum aestivum L.)为受试生物,研究了土壤中甲苯、乙苯和二甲苯等苯系物(TEX)的毒性效应.结果表明,3种污染物对赤子爱胜蚓和小麦毒性影响呈明显的剂量-效应关系,甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓的24hLC50分别为583.6,346.8,192.4mg/kg;48h LC50分别为454.3,167.1,127.2mg/kg.甲苯、乙苯和二甲苯对小麦芽伸长的10%抑制率(IC10)分别为342.2,195.4,45.9mg/kg;对小麦根伸长的10%抑制率(IC10)分别为206.7,134.5,26.3mg/kg.小麦芽长、根长均可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但小麦种子根长对3种污染物胁迫的响应较芽长更为敏感,根长抑制率与芽长抑制率之间呈明显的相关关系.     

稀土元素钕对菲律宾蛤仔金属硫蛋白的诱导效应

稀土元素能否诱导海洋生物合成MTs(金属硫蛋白),将影响到MTs对海水重金属的指示作用. 以菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)为试验动物,采用含稀土Nd3+的人工海水对其进行暴露培养,测定蛤仔鳃部和内脏中MTs含量随暴露剂量和时间的变化. 结果表明,Nd3+暴露能够增加蛤仔体内MTs含量. ρ(Nd3+)为0.1～10 μg/L时能明显促进蛤仔鳃和内脏MTs的合成;蛤仔在ρ(Nd3+)为1 μg/L下暴露培养7 d,内脏MTs含量达到最高水平;同时,光谱扫描及SDS-PAGE分析表明,Nd3+诱导的蛤仔内脏中MTs在258 nm处有特征吸收峰,主要以二聚体和三聚体的形式存在,分子质量分别为13.0和18.1 ku.      

植物修复多环芳烃研究现状

植物修复是一种利用植物修复环境污染物的方法 ,由于其费用低廉等特点正受到越来越多的关注。多环芳烃由于其毒性、致癌性和致畸性成为环境中一类重要的污染物。概述了植物修复的机制 ,并回顾近年来国内外关于植物修复多环芳烃方面的研究进展。     

HRT对A2O工艺中典型多环麝香迁移转化的影响

研究了不同水力停留时间(hydraulic retention time,HRT)条件下佳乐麝香(galaxolide,HHCB)与吐纳麝香(tonalide,AHTN)在A2O工艺各池水相和泥相中的变化情况.采用固相萃取与气相质谱联用的方法对水相与泥相中目标物的质量浓度进行检测.结果表明,HRT主要影响HHCB在A2O工艺中的生物降解和随剩余污泥排放的比重,影响AHTN随剩余污泥排放的比重.随着HRT的增大,HHCB、AHTN在厌氧池中的去除率与去除贡献率逐渐减小,而缺氧池与好氧池的去除率与去除贡献率相对增大.2种目标物在4个HRT工况(6、8、10、12 h)下的总去除率分别为73.93%、73.05%、75.14%、76.00%和48.76%、44.27%、57.17%、62.9%.A2O工艺对HHCB的去除效果较好,而对AHTN的去除效果较差.HRT的增大对HHCB的去除影响不大,而对AHTN的去除有促进作用.     

Soil pollution by polycyclic aromatic hydrocarbons: A comparison of two Chinese cities

Soil samples from Huizhou and Zhanjiang, China were analyzed for 16 priority polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with harmonized sampling, sample extraction and analysis quantification methods. The concentrations and sources of PAHs in soil samples of the two cities were compared. Almost all of the PAH components were detectable in 103 soil samples. The concentrations of ΣPAHs ranged from 35.40 to 534.5 g/kg in soil samples from Huizhou, and ranged from 9.50 to 6618.00 g/kg in samples from Zhanjiang. Evident differences of concentrations, compositions and sources of PAHs in soils were observed between the two cities. The average concentrations of individual component and the sum of a group of PAHs in soil samples from Zhanjiang were significantly higher than those in Huizhou (P < 0.05). Phe, Flu, Pyr, Bbf and Baa were the dominant PAH components both in soil samples from Huizhou and Zhanjiang. Except for these five components, Bap, I1p, Daa and Bgp were also the dominant PAH components in soil samples from Zhanjiang. Coal combustion and liquid fossil fuel combustion were the same sources of PAHs in the two cities with different contributions, and petroleum played a key role in PAHs release in Zhanjiang.     

多环芳烃及其衍生物在北京典型污水处理厂中的存在及去除

多环芳烃衍生物(SPAH)除可以通过燃料不完全燃烧直接排放到环境中,也可通过光化学或微生物作用由母体多环芳烃(PAH)转化生成.部分SPAH毒性强于其相应母体PAH.通过采集北京地区污水处理厂进出水样品,分析氧化PAH(OPAH)、甲基PAH(MPAH)、硝基PAH(NPAH)三类SPAH和16种PAH的质量浓度,研究此类目标物在污水生物处理过程中的存在和行为.结果表明,MPAH、OPAH和PAH存在于污水处理厂进出水中,但NPAH未检出.进水水相和颗粒相中总质量浓度PAH为1.94~4.34μg·L~(-1),SPAH为1.16~2.20μg·L~(-1),出水水相和颗粒相中总质量浓度PAH为0.77~0.98μg·L~(-1)和0.39~0.45μg·L~(-1).MPAH的质量浓度一般低于其相应母体PAH,而OPAH质量浓度一般高于其相应母体PAH.目标物在污水处理厂中的去除率为53%~83%.活性污泥法对于PAH和SPAH类物质的去除途径主要为吸附及生物降解,部分OPAH可能在污水生物处理过程中由母体PAH转化生成,并有积累.PAH主要来源于木柴和煤的不完全燃烧,部分来自于石油燃烧,只有小部分来源于石油排放.秋季进出水中PAH和SPAH质量浓度高于冬季高于夏季.大部分SPAH和PAH随河水灌溉排入天津农田区,可能会对人体健康造成潜在危害.因此,需要通过对污水处理厂处理工艺的升级改造以提升对PAH和SPAH类物质去除效果.     

用尿中1-羟基芘评价人体暴露PAHs的肺癌风险

 采集并分析了100名不吸烟成人24h呼吸的空气样品和尿液样品,建立了人尿中1-羟基芘(1-OH-Py)浓度与苯并(a)芘(BaP)、芘(Py)等14种多环芳烃(PAHs)呼吸暴露浓度的定量关系.参考现有关于BaP空气污染浓度与肺癌死亡率的剂量-反应关系模型,推导出用尿中1-OH-Py预测人体呼吸暴露PAHs的肺癌风险模型.用建立的模型对100名受试者进行了肺癌风险评价,结果表明,一般人群BaP暴露的肺癌风险约为11/10万,焦炉工人约为160/10万;若同时考虑14种PAHs的BaP当量毒性,则其相应肺癌风险要高出约0.5倍.一般人群的尿中1-OH-Py的生物暴露限值为0.11μmol/mol肌酐,焦炉工人为1.90μmol/mol肌酐.     

多环芳烃及其衍生物在北京纳污河流中的分布及健康风险

为探明北京5座污水处理厂出水及受纳河流中多环芳烃(PAHs)及其衍生物(SPAHs)的污染水平及健康风险水平,采用固相萃取-气相色谱质谱联用仪测定水样中的PAHs及SPAHs的质量浓度,分析其分布特征,同时使用毒性当量因子评价河流中PAHs的健康风险.结果表明,5座污水处理厂出水及受纳河流中PAHs及SPAHs总质量浓度分别为75~584 ng·L~(-1)和91~1822 ng·L~(-1).水样中PAHs以2和3环为主,占PAHs总量的23%~48%.本研究中的SPAHs包括三类物质:氧化PAHs(OPAHs)、甲基PAHs (MPAHs)和氯代PAHs (Cl PAHs).其中,OPAHs占ΣSPAHs的质量分数为75%,MPAHs、Cl PAHs占比总体较低,分别为12%、13%.通过对5条河流中PAHs进行毒性当量浓度计算,表明应在采暖季(12月)对高环PAHs污染引起重视.