差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势

BACKGROUND: As the main function cell of intervertebral disc, nucleus pulposus cells are the focus of studying the degenerative mechanism; thereby, it is crucial to maintaining the physiological function of nucleus pulposus cells in vitro and the stability of the cell phenotype. OBJECTIVE: To study the excellence of differential velocity adherent procedure in primary culture of nucleus pulposus cells of rat intervertebral disc through comparison. METHODS: Twenty male Wistar rats aged 4 weeks were enrolled, and then nucleus pulposus cells of intervertebral disc were isolated and cultured in vitro; cell passage culture was performed in different groups when the primary cells were merged to 90%. Differential velocity adherent group cells adhered for 30 minutes, and non-adherent cells were aspirated and transferred to new culture dish after readjusting the concentration; the controls received no intervention. Passages 1 and 2 cells in the differential velocity adherent group were isolated and purified by the same procedure. The morphology of three generations of cells in the two groups was compared, the purity of the identification was detected by immunohistochemistry, the cell viability was detected by cell counting kit-8 and the cell growth curve was drawn. RESULTS AND CONCLUSION: Inverted phase contrast microscope and hematoxylin-eosin staining revealed that the cell homogeneity of the differential velocity adherent group was significantly higher than that of the control group, and there were more kinds of fibroblast-like cells in nucleus pulposus cells in the control group. Identification and purity analysis of collagen type II showed that the cytoplasm of two groups were both stained brown, indicating that they were the nucleus pulposus chrondrocytes. The positive rate of differential velocity adherent group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). The cell growth curve of cell counting kit-8 showed cells in the two groups all passed by the latency phase within 2 days, then to the logarithmic phase of 3 days, and entered the lag phase, while the growth rate of the control group was more rapid during the latency and the early logarithmic phases. These findings suggest that differential velocity adherence method is a practical and effective procedure for the isolation and purification of primary cultured rat nucleus pulposus cells. Through the primary culture, twice differential velocity adherence procedure, the passage 3 rat nucleus pulposus cells are metabolic exuberant, consistent with the phenotype, the cell purity is higher, and the logarithmic growth phase can be used as the optimal time for studying the mechanism of intervertebral disc cells. 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从大鼠腹股沟脂肪垫分离纯化脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的可行性。方法:采用差速贴壁培养法分离ADMSCs,并与普通培养法得到的ADMSCs进行表面分子CD44阳性率对比。在第2代ADMSCs中加入条件培养基进行诱导,根据条件培养基的不同分成3组:①成骨诱导组:加入成骨培养基;②成脂诱导组:加入成脂培养基;③对照组:仅加入基础培养基。成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶(ALP)检测,成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测。结果:差速贴壁培养法获得CD44阳性率更高的ADMSCs。成骨诱导组的ALP大大高于对照组,成脂诱导组油红O染色阳性,对照组油红O染色均为阴性。结论:差速贴壁培养法从大鼠腹股沟脂肪垫中分离得到高纯度ADMSCs。     

大鼠远端肺动脉平滑肌细胞分离与原代培养

目的 探索简便、高效原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的方法,为研究肺动脉高压发病机制提供实验材料.方法 采用显微操作和分次酶消化法进行原代培养并与传统酶消化法比较.对培养的细胞进行形态学观察、平滑肌α-actin免疫荧光细胞化学法鉴定、激光扫描共聚焦显微镜计算纯度.结果 两种酶消化法均可获得高纯度的远端肺动脉平滑肌细胞.镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞质特异的α-actin阳性表达,细胞纯度达98%.分次酶消化法获得的细胞数及细胞存活率均大于传统酶消化法,并且提前了3 d得到足够进行实验的细胞数量.结论 本法简便、可靠、低成本,短期内可获得大量高纯度、功能良好的远端肺动脉平滑肌细胞.     

大鼠远端肺动脉平滑肌细胞分离与原代培养

目的探索简便、高效原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的方法,为研究肺动脉高压发病机制提供实验材料。方法采用显微操作和分次酶消化法进行原代培养并与传统酶消化法比较。对培养的细胞进行形态学观察、平滑肌α-actin免疫荧光细胞化学法鉴定、激光扫描共聚焦显微镜计算纯度。结果两种酶消化法均可获得高纯度的远端肺动脉平滑肌细胞。镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞质特异的α-actin阳性表达,细胞纯度达98%。分次酶消化法获得的细胞数及细胞存活率均大于传统酶消化法,并且提前了3d得到足够进行实验的细胞数量。结论本法简便、可靠、低成本,短期内可获得大量高纯度、功能良好的远端肺动脉平滑肌细胞。     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

退变髓核细胞与正常髓核细胞体外培养的生物学特性对比

目的:比较体外培养的退变髓核细胞与正常髓核细胞生物学特性的差异。方法:将成年新西兰大白兔以纤维环穿刺法椎间盘造模法处理,4周后取退变以及正常髓核细胞,进行细胞形态及电镜观察、MT法试验,检测细胞周期及主要细胞外基质相关基因表达情况。结果:细胞生长曲线显示,传4代细胞第5天开始出现生长减慢,传5～7代细胞均在接种后第2～3天细胞数量明显减少(P<0.05);退变髓核细胞传3代细胞第4天开始出现生长减慢(P<0.05),传5代时即出现生长滞缓,传7代时出现生长停滞。髓核软骨样细胞MTT摄取实验,传4～7代细胞的吸光度值明显低于传1代(P<0.05)。正常和退变髓核细胞细胞所处生长分裂期对比中,正常和退变髓核细胞G1期细胞所占比例具有统计学差异(P<0.05)。结论:大白兔正常髓核细胞持续增殖能力、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原DNA的含量均较退变髓核细胞高,能为椎间盘组织工程学、细胞生物学疗法等提供理论基础。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究。 目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。 方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。 结果与结论：差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72 h左右贴壁生长,经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。     

牛髓核软骨样细胞原代培养及异种移植组织相容性观察

背景：自体或同种异体细胞移植进行椎间盘再生已成为临床研究的热点。 目的：探索牛椎间盘髓核软骨样细胞原代提取条件及培养方法,观察其植入兔椎间盘中组织相容性。 方法：提取新鲜的牛尾椎间盘中的髓核组织,分离并体外培养牛髓核软骨样细胞。经腹后外侧途径采用微量加样针将扩增过的牛髓核软骨样细胞注入新西兰大白兔的椎间盘中。分别在移植后的2,4,6及8周收集接受牛髓核软骨样细胞移植的兔椎间盘,以冰冻免疫组织化学法检测CD5或CD4细胞表面抗原的表达及B或T淋巴细胞的浸润,判断是否发生免疫排异反应。 结果与结论：实验分离出了活牛软骨样细胞,在体外进行了传代扩增。在移植后2,4,6及8周对L3/4,L4/5,L5/6椎间盘及腹腔淋巴结行抗兔CD4、CD5染色后未发现阳性表达,椎间盘局部无B或T淋巴细胞的浸润。移植入兔椎间盘8周,经冰冻免疫组织化学检测未发现免疫排异反应。说明原代培养的牛椎间盘髓核软骨样细胞组织相容性较好。     

原代培养大鼠海马细胞随培养时间早期凋亡和死亡增加

神经细胞在原位组织已经完成分裂和分化,培养的神经元将不会分裂、增殖,其数目也会随着培养时间的延长而减少,但目前还没有见到对原代培养过程中神经细胞凋亡以及死亡情况的研究。利用Annexin V-PI双染法可以将凋亡早期与凋亡晚期和死亡细胞区分开,本研究将分别收获第0、1、3、5、8、11及18d细胞进行Annexin V-PI染色,利用流式细胞仪来研究在原代培养过程中神经元的早期凋亡和死亡。     

大鼠睾丸支持细胞的原代培养与鉴定

目的采用改良方法对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和原代培养,为得到更高纯度和稳定的支持细胞原代培养体系,并建立一种简单、易行的支持细胞鉴定方法。方法采用酶消化法分离大鼠睾丸支持细胞,用Tris-HCI处理后除去生精细胞,实现进一步纯化。并用Feulgen染色法鉴定支持细胞,对支持细胞进行形态学观察。结果培养的支持细胞纯度达到95％,每个睾丸可获取支持细胞约10^7个,Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行,且细胞纯度较高。     

兔髓核细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为髓核细胞的研究

目的 研究体外新西兰大白兔髓核细胞(nucleus pulposus cells)与SD大鼠骨髓间充质干细胞(mes-enchymal stem cells,MSCs)共培养时,兔髓核细胞与大鼠MSCs直接和间接接触对MSCs分化为髓核细胞的影响.方法 DAPI (4‘,6-二咪基-2‘-苯吲哚盐酸)标记原代髓核细胞后,分别与第三代MSCs按接触组和非接触组(Transwell培养系统)共培养.每隔24小时应用免疫荧光观察MSCs的形态学变化,并用RT-PCR方法检测Ⅱ型胶原和可凝集蛋白多糖(Aggrecan)的表达.结果 直接接触培养组中可见分化的MSCs形态和功能接近髓核细胞;非直接接触组的MSCs未见变化.结论 髓核细胞与MSCs的直接接触,是诱导MSCs分化为髓核细胞的重要因素.     

新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及标记方法

本文用等密度沉降离心法分离出新生大鼠骨骼肌卫星细胞,观察其生长规律,检测分裂指数及生长曲线。用胶体金、DAPI及Brdu标记液分别标记细胞8、24、48h,测标记后细胞的生长曲线及标记率。结果表明分离所得肌卫星细胞纯度95％以上,梭形,培养第5天细胞排列出现方向性,并开始融合成肌管,第3—5天增殖旺盛,5代以内生长较快。三种标记方法对肌卫星细胞有不同程度毒性。胶体金标记法毒性最小,标记率100％;DAPI标记细胞率为100％;Brdu毒性最大且标记率仅为10％。本实验方法简单、快速,所得肌卫星细胞纯度高,性能好。胶体金标记法适合于电镜研究,DAPI标记法适合于光镜研究,Brdu标记法较差。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。     

SD大鼠胰岛的分离纯化及培养

目的探讨分离纯化大鼠胰岛素分泌细胞的方法,并评价细胞的生物学特性。方法选用3～4周龄健康成年SD大鼠,常规外科手术显露SD大鼠胰腺和胆总管,在胆总管内插入4.5～5号头皮针后固定,逆行注入预冷的0.5mg/ml的胶原酶V溶液8～10ml,使胰腺膨胀后迅速取出胰腺放入6mlHanks液中38℃消化10min,用含10%胎牛血清的Hanks液终止消化,60目筛网过滤后用Ficoll400非连续梯度离心纯化胰岛。纯化后的细胞用DTZ染色和胰岛素释放试验来分析胰岛素的分泌情况。结果 DTZ染色后β细胞胞浆着色,为均一的猩红色。胰岛细胞分布于Ficoll400浓度为23%～20%和20%～11%的界面之间,纯度高达90%,并且细胞的胰岛素分泌情况良好。结论胶原酶V消化,Ficoll400纯化是一种简单高效的胰岛素分泌细胞分离纯化的方法,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛素分泌细胞。     

正常与退变髓核细胞的变形能力

背景：细胞的变形能力在较大程度上能反映出细胞结构与功能的改变,目前对髓核细胞在细胞力学方面的研究较少。 目的：分析正常和退变髓核细胞的变形能力。 方法：正常髓核组织和退变髓核组织分别取材于3例脊柱侧弯患者和3例椎间盘突出患者术中取出的废弃髓核组织,用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分离提取细胞,行原代培养,通过微管加载装置适宜负压下测量细胞在第4秒时吸入微管的长度,并行统计学处理。 结果与结论：正常髓核细胞和退变髓核细胞所用的负压分别为(411.31±27.93) Pa,(434.24±46.26) Pa,差异有显著性意义(P < 0.05)。在4 s时吸入长度分别为(2.20±0.92) μm,(2.48±0.71) μm,差异无显著性意义(P > 0.05)。结果可见在规定时间的情况下,吸入微管的长度基本相同时,退变髓核细胞所需要的负压较正常髓核细胞大,说明退变髓核细胞的变形能力比正常髓核细胞差。