秦岭链霉菌的原生质体再生与诱变育种

在秦岭链霉菌(Streptomyces qinlingensis sp. nov.)的菌种改良中, 应用原生质体再生并结合物理化学诱变能够得到产量较高、稳定性较好的菌株。筛选实验表明：秦岭链霉菌原生质体再生菌株R-72、诱变菌株NTG-1和H30-7对枯草芽孢杆菌的抗菌活性均提高了20%以上, 并且连续培养10代, 其遗传性状均比较稳定。进一步的生测实验表明菌株R-72、NTG-1和H30-7对5种病原细菌和5种植物病原真菌的抗菌活性相比原始菌株有显著提高。     

阿维链霉菌bkdAB的基因中断对阿维菌素合成的影响

以阿维菌B组分菌株StreptomycesavermitilisBjbm0 0 0 6为出发菌株 ,用PCR的方法构建bkdAB基因簇(Branched_chainα_ketoaciddehydrogenasegeneAB)的基因置换质粒pHJ582 1(pHZ13 58∷bkdAB&erm) ,并对其进行基因中断 ,得到重组菌株Bjbm582 1。Bjbm582 1的发酵产物经HPLC检测发现 ,除了产生B1a和B2a外 ,还产生一种原菌株没有的新组分 ,3个组分的总含量只有出发菌株Bjbm0 0 0 6的 2 5%。结果表明bkdAB的中断不仅部分阻断了阿维菌素的合成 ,还阻断了阿维菌素b组分的合成 ,可以推测bkdAB的产物在阿维菌素合成途径中主要承担了α酮基异戊酸脱氢酶 (α_ketoisovalericaciddehydrogenase)角色     

阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1139∷△aveD)对阿维菌素(Avermectin)产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76\|9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现该突变株只产生阿维菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同,突变株中B1的产量略有提高,阿维菌素B2的含量显著提高。     

重离子辐照诱变阿佛曼链霉菌的实验观察

目的：对阿佛曼链霉菌采用新的诱变手段,以获得稳定高产的优良菌株。方法：采用重离子束辐照阿佛曼链霉菌,研究了0.25Gy、0.5Gy、3Gy、5Gy、10Gy和15Gy剂量的12C＋粒子束辐照阿佛曼链霉菌菌株后,菌落特性的变化及对菌株产素能力的影响。结果：重离子辐照阿佛曼链霉菌后,在其各个辐照剂量区都存在变异菌株,诱变后阿佛曼链霉菌的菌落形态多样,小山状,火山口状、彗星尾状、车轮状、边缘放射状等;菌落大小不一,有的直径达4～5mm,有的小如针尖状。效价提高到7298μg/mL,获得了高产菌株。结论：重离子束辐照阿佛曼链霉菌菌株后,阿佛曼链霉菌的产素能力显著提高,可得到高产的菌株。     

阿维链霉菌孢子色素生物合成对阿维菌素产量的影响

以野生型阿维链霉茵NRRL8165为出发菌株,用PCR方法克隆孢子色素基因簇直系同源基因(whiEa)侧翼片段,并构建基因置换载体pHL643.将pilL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,通过置换载体和染色体之间的同源双交换,对染色体上的whiEa基因簇进行置换,得到3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株,均表现为孢子色素合成缺陷.通过Southern杂交分析,证明whiEa基因簇被置换.通过摇瓶发酵和HPLC检测,发现whiEa基因簇置换菌株所产阿维菌素产量明显提高,表明孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象.     

阿维莲霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1139::△aveD)对阿维菌素（Avermectin）的产生菌阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现该突变株只产生阿链菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同,突变株中B1的产量略有提高,阿维菌素B2的含量显著提高。     

阿维链霉菌发酵培养基的优化

通过优化发酵过程中培养基的组成使得阿维链霉菌的发酵单位及有效组分Bla含量提高。采用单因子试验法及均匀设计试验法分析各种营养成分及其配比对阿维链霉菌Co39-15发酵单位和有效组分Bla含量的影响。获得最佳的种子培养基和发酵培养基配方,发酵单位及有效组分Bla含量比原来的发酵水平分别提高了20%～30%、8%～10%。利用单因子试验法及均匀设计试验法对抗生素的发酵培养基进行优化,是一种快速、效果显著的方法。     

南昌链霉菌的微波诱变

以微波对南昌链霉菌进行了微波育种,获得梅岭霉素杀虫剂生产能力高于出发菌株73％的W4-311。该菌株经多次传代,遗传性状保持稳定。     

阿维链霉菌NRRL8165中bldAa的克隆及其对形态分化与阿维菌素合成的影响

bldA编码天蓝色链霉菌中唯一有效识别UUA亮氨酸密码的tRNA(Leu)UUA。通过构建阿维链霉菌NRRL8165基因组亚文库,筛选得到含有阿维链霉菌bldAa及其侧翼序列的克隆。利用λRED介导的PCRtargeting技术构建了bldAa的基因置换质粒pHL358,将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,筛选得到bldAa基因置换菌株TW10。TW10表现为光秃表型,表明bldAa调控阿维链霉菌的形态分化。摇瓶发酵TW10菌株并对发酵产物进行HPLC分析,发现TW10菌株均不合成阿维菌素组分,提示阿维菌素的合成受bldAa调控;考察阿维菌素生物合成基因簇,其中aveA3和aveR含有TTA密码,它们的翻译可能受bldAa调控,与实验结果一致。     

Stimulation of avermectin B1a biosynthesis in Streptomyces avermilitis by feeding glucose and propionate

The biosynthetic ability of avermectin B1a in Streptomyces avermilitis was improved with propionate addition and glucose feeding. The results showed that B1a production was increased by 12.8–13.8% through supplement of 0.8% propionate at 24 h of cultivation. A stronger stimulation on B1a biosynthesis in S. avermilitis was observed by 3.0% glucose feeding at 5 d of cultivation. The B1a biosynthesis could be further enhanced by repeated glucose fed-batch process in a 10-l bench-top fermentor. A maximal B1a concentration of 780.0 mg/l was obtained by repeated 1.0% glucose addition on 4 d, 5 d and 6 d, which was 2.1-fold higher than that in a control fermentation. Corresponding with this, an additional 6.8% increase of B1a proportion was observed in comparison with the control process. This stimulation on avermectin B1a production was obvious even in a 2000-l fermentor under suitable control of aeration.     

植物抗逆诱变育种技术研究进展

随着分子生物学技术的飞速发展,通过基因工程方法可以更快更好地获得农作物抗逆新品种,其首要任务是通过分离相应的表型改变的突变体来鉴定、克隆在胁迫条件下表达模式发生改变的基因。主要介绍几种常用的及最新的突变体诱变和筛选技术,并分析每种技术的优缺点。     

阿维菌素高产菌株的选育Ⅰ

目的：全面了解阿维菌产生菌S.avermitilis的生长特性并获得阿维菌素的高产菌株。方法：以S.avermitilis Y20为出发菌株,考察该菌株的菌落特征和发酵特性,分别利用紫外线（UV）、亚硝酸（HNO3）及亚硝基胍（NTG）并结合L－异亮氨酸（L－Ⅱe）诱导等手段对出发菌株Y20进行诱变处理。结果：获得高产阿维菌素变异株H336,发酵单位达到852μg/ml。结论：与出发菌株相比,突变株阿维菌素的产量稳定,发酵单位提高了10倍以上。     

血红铆钉菇氨基酸缺陷型菌株的紫外诱变选育

通过原生质体去细胞壁技术,以血红铆钉菇原生质体为材料,利用紫外线对其进行诱变处理,筛选出6株氨基酸营养缺陷型突变株,经稳定性试验确认1株突变株性状可以稳定遗传,利用生长谱法对缺陷型进行了鉴定、分析。结果表明,该菌株为L-半胱氨酸缺陷型菌株,为营养缺陷型突变株的筛选奠定了基础。     

阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育

以阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)1-17为出发菌株,分别使用紫外线及亚硝基胍并结合L-异亮氨酸诱导手段进行诱变处理,得到AVMB1a组分摇瓶发酵水平较出发菌株提高12.86%的突变株3-6.传代实验表明该菌株的高产性能稳定.结果表明,采用UV、NTG诱变结合L-Ile诱导的手段可以获得B1a组分显著提高的菌株.     

Organization of biosynthetic gene cluster for avermectin in Streptomyces avermitilis: analysis of enzymatic domains in four polyketide synthases

The analysis of the incorporation of ¹³C-labeled precursors into avermectins indicates that the avermectin aglycons are synthesized by head-to-tail condensation of various acyl groups, which is similar to the biosynthesis of other polyketides. Polyketide synthases (PKS) use the appropriate CoA ester as a primer and add acetate units from malonyl-CoA and propionate units from methylmalonyl-CoA to assemble the polyketides. Avermectin aglycons are formed by addition to the starter unit (2-methylbutyrate or isobutyrate) of 12 acyl condensations in the order P–A–A–A–A–P–P–A–P–A–P–A (P, propionyl; A, acetyl). Within the 90-kb gene cluster for avermectin biosynthesis, the central 65-kb segment was found to be required for aglycon biosynthesis by phenotypic analysis of strains containing deletion or insertion mutations in this region. A complete sequence analysis of the 65-kb segment indicated that this segment encodes avermectin PKS. The avermectin PKS genes are organized into two converging blocks of ORFs. From the results of sequencing analysis, a feature of the two regions, aveA1/aveA2 and avea3/aveA4, is that they encode four kinds of large multifunctional polypeptides containing 55 domains which possess putative fatty acid synthase-like activities. The avermectin PKS (AVES 1–4) appear to contain two, three, or four modules. AVES 1 and 2 contain two and four modules, respectively, whereas AVES 3 and AVES 4 each contains three modules. The 12 modules correspond to the 12 cycles required for synthesis of the avermectin aglycon. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 27, 170–176. Received 21 September 1999/ Accepted in revised form 14 September 2000     

链霉菌LA5高产菌株诱变育种研究初报

抗生素LA5具有开发成抗真菌农用抗生素的广阔前景,但由于该菌株的野生型菌株发酵效价低,不能满足工业化开发的要求。通过以链霉菌LA5为出发菌株,采用紫外线(UV)、微波、亚硝基胍(NTG)、紫外线 亚硝基胍、亚硝基胍 紫外线等方法进行诱变筛选,结果表明,以紫外线照射80 s 亚硝基胍处理80 min的诱变的正突变率最高,为30%,其他依次为亚硝基胍处理80 min 紫外线照射40 s诱变和亚硝基胍处理60min 紫外线照射120 s诱变,正突变率均为26%。然后依次使用亚硝基胍处理80 min 紫外线照射80 s、亚硝基胍处理80 min 紫外线照射40 s、亚硝基胍处理60 min 紫外线照射120 s进行第2、第3、第4轮复合诱变筛选,最后选育出突变菌株U8-N8A-196,其产抗生素能力比链霉菌LA5出发菌株提高了34.5%,极显著高于LA5菌株。     

降胆固醇嗜酸乳杆菌的诱变选育

通过诱变获得具有降胆固醇功能的优良嗜酸乳杆菌新菌株。利用亚硝基胍(作用浓度为1 g/L)对嗜酸乳杆菌进行诱变。突变菌株测定其耐渗透压和抗胆盐能力后,在含有0.3 g/L胆固醇的培养基中培养48 h,测定降胆固醇率。挑选优良突变菌株制成酸奶并喂养高脂大鼠模型,28 d后测定血清及粪便胆固醇指标。嗜酸乳杆菌突变后获得的60个突变菌株中有8株具有良好的耐渗透压和抗胆盐能力,其中突变株Y48的清除胆固醇能力最高,清除率达到(61.44±1.8)%。Y48发酵酸奶喂养高脂大鼠模型28 d后与对照大鼠模型相比,血清中TC、TG明显减少(P<0.05),粪便TC明显增加。通过诱变获得了优良的嗜酸乳杆菌突变菌株,为今后获得优质降胆固醇乳酸制品提供良好的候选菌种。     

空间诱变育种的分子标记技术

空间诱变是一种新型的生物育种手段。本文主要根据国内外生物空间诱变的研究报道,整理、总结了应用于空间诱变领域中的RAPD、SCAR、SSR、RFLP等DNA分子标记技术,并比较了其优缺点,讨论了DNA分子标记技术在空间诱变育种研究中存在的问题及其应用前景。