苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因穿梭质粒的构建

在农业生产中长期使用化学农药已对环境和生态平衡造成一定破坏作用,同时有不少害虫也逐渐产生抗药性从而引起某些害虫的大流行,给农业生产带来巨大损失。应用苏云金杆菌杀虫蛋白基因(Bt基因)可构建具有抗虫作用的抗虫工程菌,这样通过拌种或植物叶面喷雾可达到快速、经济、有效的防治虫害的目的。国际上抗虫工程菌研究应用很快,如美国将BI基因转入到一种正常情况下定居在植物组织中的棒杆菌,将这种工程菌拌玉米种子,这样随植物生长该菌在植物体内大量繁殖,当玉米螟在茎和叶取食时,即因食用表达苏云金杆菌毒蛋白的工程菌而死亡。 田颖川等已克隆了苏云金芽孢杆菌内毒素基因CryIA(b)和CryIA?。本文将Bt基因CryIA?插入到大肠-枯草穿梭载体pBE-2中构建成Bt毒蛋白基因穿梭质粒pAMY,利用电穿孔法转人大肠杆菌DH5a,枯草芽孢杆菌B.subtilis BR151,IA511,野生型蜡状芽孢杆菌B.cereusa-47,短芽孢杆菌B.brevis A-5和枯草芽孢杆菌90-8,获得了具有较高杀虫活性的工程菌克隆。     

苏云金芽孢杆菌δ—内毒素的杀虫机理及其增效途径

苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）制剂是当前应用最广、最有效的微生物杀虫剂。Ｂｔ属于革兰氏阳性细菌,在形成芽孢的同时,产生伴孢晶体。伴孢晶体是Ｂｔ杀虫活性的主要来源,它可能由几种晶体蛋白即δ－内毒素组成。δ－内毒素的专一...     

苏云金杆菌δ—内毒素基因在大肠杆菌中的克隆及表达

分离了苏云金杆菌肯尼亚亚种7404(Bacillus huringiensis subsp．Kenyae 7404)和库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp．Kwrstaki HD-1)的质粒。经凝胶原位杂交证明苏云金杆菌肯尼亚亚种7404的δ—内毒素基因位于约47Md大小的一个质粒上。用蔗糖密度梯度离心法从sau 3 A1部分酶解的上述两种苏云金杆菌质粒DNA酶解片段中分离出大于 4kb的DNA片段,将这些片段克隆到pBR332的Barn HI位点上并转化大肠杆菌HB101。通过菌落原位杂交、菌落原位放射免疫试验及Western blct分析等方法,选到了带有δ—内毒素基因并能在大肠杆菌中表达此毒蛋白的转化体。初步的生物学试验表明,在四个试验过的转化体中带有肯尼亚亚种δ—内毒素基因的转化体TK89及带有库斯塔克亚种δ—内毒素基因的转化体THl2和TH48对烟青虫(Heliothis assulta)有毒杀活性。     

苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展

从cry基因的分类、cry基因与转座因子的关系、cry基因的表达调控以及cry基因的作用机理等 4个方面综述了cry基因的研究进展 ,并简要展望了其研究和应用前景。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ-内毒素基因导入野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导入几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数,计算出转化效率为10~1—10~4转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌穿梭质粒的构建和特性研究

将苏云金芽孢杆菌中的pHTA1030质粒与大肠杆菌中的pJH101质粒重组后,构建出pBHGA重组质粒。此质粒通过逐步酶切,缺失后重组得到了14个分子量大小不同的衍生重组质粒。经过对pBHG1重组穿梭质粒在E.coli HB101和B.subttlis 168受体中表达的分析,证明了它带有B.thuringiensis(简写作B.t.)质粒的启动区、启始复制区和对热分离稳定区基因片段,并能高频转化B.t.受体细胞和高表达外源cat基因,同时具有对热分离稳定的特性。为B.t.基因工程体系提供了高效转化表达载体。     

化学物质和保存条件对苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的影响

研究了几种化学物质及保存温度与时间对几种苏云金杆菌δ-内毒素的毒力和晶体蛋白质的影响。结果表明,在所用浓度范围内,农乳600、二甲苯及氯氰菊酯对δ-内毒素的毒力有不同程度的影响。三种化学物质分别与伴孢晶体的混合物,室温下存放5个月或1年,其毒力有较明显到大幅度的下降。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,室温下存放6个月,各化学物质处理的晶体蛋白质被轻微、明显或完全降解。蒸馏水中的伴孢晶体,室温或-20℃下存放,毒力下降较缓慢,晶体蛋白质的降解程度亦较低。不同变种的δ-内毒素蛋白质的稳定性有差别。讨论了上述     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达

构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R.该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成.试验结果表明,该穿梭表达载体pBE2R可以在大肠杆DH5α和枯草芽孢杆菌WB600中稳定存在,并可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,同时也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台.     

碳源对苏云金芽胞杆菌融合基因cry1D-lacZ表达的影响

本研究检测了在不同遗传背景的苏云金芽胞杆菌菌株中不同碳源对杀虫晶体蛋白cry1D-lacZ融合基因表达的影响。研究表明,cry1D-lacZ在同一菌株中的表达因碳源不同而异,在碳源相同的条件下不同菌株的表达也不相同,而衍生菌株HD-133-5的代谢途径非常特殊。琥珀酸钠作碳源时导致芽胞形成提前,cry1D-lacZ融合基因表达也随之提前。而以乙酸钠作碳源时,在不同亚种的菌株中都能高水平、持续稳定地表达。 Abstract:In order to investigate the influence of the carbon source on the expression of cry1D-lacZ in Bacillus thuringiensis with different genetic backgrounds,cry1D-lacZ was introduced into different strains and cultured in liquid medium containing different carbon sources.Analysis of activity of β-galactosidase showed that cry1D-lacZ expressed differenfly in the same host because of different carbon sources and differenly in different hosts utlizing same carbon sources,suggesting that metabolism pathway of carbon sourcein HD-133-5 was special.Sodium succinate as carbon source could lead to earlier.sporulation and earlier expression of cry1D-lacZ.When sodium acetate acted as carbonsource,cry1D-lacZ could keep high,stable expression in different hosts.These results arehelpful for future fermentation of Bacillus thuringiensis.     

苏云金芽孢杆菌Bt-3701与巨大芽孢杆菌Bm-107种间原生质体融合

具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(B. thuringensis subsp kurstaki)Bt-3701与具有解磷活性的巨大芽孢杆菌(B. megaterium var. phosphaticum)Bm-107原生质体进行了融合。Bt-3701原生质体形成率为99.4％,再生率为21.4％;Bm-107原生质体形成率为97.5％,再生率为23.8％。以PEG为助融剂进行原生质体融合,得到22个融合子,融合率达6.03×10^(-3)。融合子在双抗培养基(DR-CNB)上连续传代12次,得到4个稳定的融合于生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解磷活性。     

棉铃虫中肠类胰蛋白酶的部分纯化和性质测定及其对苏云金杆菌δ—内毒素的降解作用

将棉铃虫Helicoverpa armingera中肠液经SephadexG-75、DEAE-SephadexA-50阴离子交换和CM-SephadexC-50阳离子交换柱层析进行分离纯化,得到部分纯化的24.5kD蛋白,该蛋白可以水解胰蛋白酶的专性底物BApNA和TAME,不能水解胰凝乳蛋白酶的专性底物BTEE,蛋白酶抑制剂的抑制试验显示,TLCK、PMSF、STI及SBBI均可显著抑制该蛋白对BApNA的水解作用,而TPCK无抑制作用,由此推断,24.5kD蛋白是棉铃虫的类胰蛋白酶。以BApNA为底物,类胰蛋白酶的最适pH为10.5-11.0。SephadexG-75分离得到了4个洗脱峰,电泳结果显示,各洗脱峰均能使苏云金杆菌库斯塔克变种Bacillus thuringiensis var.kurstakiHD-1原毒素降解为60.5kD的活力片段,峰Ⅳ虽然不能水解BApNA和TAME,但仍可对原毒素进行降解,而类胰蛋白酶活力最高的峰Ⅱ已将60.5kD蛋白完全降解,当减少用量至1/3时,才出现60.5kD蛋白。因此,苏云金杆菌δ-内毒素在棉铃虫中肠内的降解有多种蛋白酶参与,类胰蛋白酶在其中起重要作用,CM-SephadexC-50进一步分离得到的类胰蛋白酶可对原毒进行降解,其降解作用受到TLCK、PMSF、STI及SBBI的显著抑制,不受TPCK的影响。     

苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种、猝倒亚种及以色列亚种为材料,介绍了低拷贝大型质粒DNA的小量提取方法,该法采用PEG 6000进行质粒纯化,省略了苯酚和氯仿抽提过程。实验证明,该法结果稳定,提取的质粒DNA产量和质量均符合大多数分子生物学实验的要求。     

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素cryIA(c)基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）δ内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ｐＫＫ２２３３重组,并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＩＰＴＧ诱导,获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ｐＨＺ１２７２中,得到重组质粒ｐＨＺ１２５６,将该质粒引入变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）ＪＴ４６中,经硫链丝菌素诱导,通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ测定表明,重组变铅青链霉菌ＪＴ４６（ｐＨＺ１２５６）已表达出相应的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素ＣｒｙＩＡ（ｃ）对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为９３％和５７％。     

苏云金杆菌δ-内毒素、芽孢及苏云金素A对棉铃虫毒性及拒食性的比较

苏云金杆菌库斯塔克变种HD-1的晶体蛋白与芽孢、HD-1无晶体突变株(Cry-)的芽孢以及苏云金素A对棉铃虫Helicoverpa armigera毒性和拒食性的比较研究显示,HD-1晶体蛋白对棉铃虫的杀虫毒力高, 拒食作用强; HD-1芽孢对棉铃虫具有一定的杀虫活性和生长抑制作用, 并有很强的拒食作用; HD-1无晶体突变株(Cry-)芽孢对棉铃虫无毒也无拒食作用;苏云金素A对棉铃虫的生长发育有极显著的抑制作用, 但对棉铃虫无拒食作用,由此证明晶体蛋白是苏云金杆菌杀虫活性和拒食作用的主要来源。苏云金素A与苏云金杆菌芽孢晶体混合物一起使用, 可使棉铃虫的死亡率显著提高。     

地衣芽孢杆菌的β－内酰胺酶基因的克隆与穿梭质粒的建造

本文简要报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)染色体上的β-内酰胺酶基因的克隆化,及以此基因为基础建造了一批能在大肠杆菌(E．Coli)和枯草杆菌(Bacillus sub-tillis)中都起作用的穿梭质粒的实验。该β－内酰胺酶基因在枯草杆菌中产生大量产物并可分泌到细胞外。     

苏云金芽孢杆菌质粒的检测及功能的初步研究

用改进的酶碱综合法检测了苏云金芽孢杆菌4个亚种11个野生菌株的内生质粒,获得良好的制备结果和重视性,对野生菌株YBT－1463及其无质粒突变株BMB171的形态和生理生化特性的比较研究结果表明,YBT－1463的内生质粒携带杀虫晶体蛋白基因,但不携带抗生素的抗性基因,且与该菌株对19种C源和12种N源的利用无关。     

苏云金芽孢杆菌δ—内毒素cryIA（c）基因在大肠杆菌和变铅青链？…

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽直菌δ－内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ＰＫＫ２２３－３重组,并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＩＰＴＧ诱导,获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ＰＨＺ１２７２中,得到重组质粒,ＰＨＺ１２５６,将该质粒引入变铅青链霉菌ＪＴ４６中,经硫链丝菌素诱导,通过Ｗ