肺炎支原体荚膜多糖抑制树突状细胞吞噬和膜分子表达

目的:了解肺炎支原体(Mp)荚膜多糖(CPS)通过结合树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(DC-SIGN)对树突状细胞吞噬功能及细胞表面膜分子表达的影响。方法:复苏培养Mp 菌株,抽提和纯化CPS。培养人外周血单个核细胞来源的DC,吉姆萨染色观察和流式细胞术(FCM)鉴定;用CPS 刺激DC,FCM 检测DC 对FITC-多聚糖的吞噬指数、DC 表面特异标志CD83、HLA-DR 抗原以及协同刺激分子CD80 和CD86 的表达。结果:培养7 d 的DC 有典型的树突状结构,并高表达CD11c 分子。经CPS 刺激后,DC 内FITC-多聚糖的平均荧光强度较对照PBS 处理组显著增加(P<0.05),DC 表面膜分子CD83、HLA-DR、CD80 和CD86 较对照组显著减少(P<0.05)。用CPS 刺激被DC-SING 受体封闭的DC,发现DC 内FITC-多聚糖吞噬指数和四种膜表面分子的表达与对照组差异均无显著性(P>0.05)。结论:Mp CPS 可促进DC 的吞噬功能和减少细胞膜分子CD83、HLA-DR、CD80 和CD86 的表达。     

吴茱萸碱对小鼠树突状细胞分泌细胞因子的影响

目的:利用抗体芯片技术和ELISA检测吴茱萸碱(EVO)对小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)分泌相关细胞因子的影响,研究EVO的生物学调节功能。方法:体外诱导培养未成熟DC细胞(iDC),经LPS和EVO处理后,通过混合淋巴反应检测DC诱导异源T细胞的应答能力,ELISA检测上清中IL-12p40、IL-12p70和IL-10,小鼠抗体芯片检测细胞上清中细胞因子。结果:EVO促进了iDC和成熟DC(mDC)抗原提呈功能(P0.05),对iDC、mDC的细胞因子IL-10、IL-12分泌功能无影响(P0.05),另外EVO处理iDC后上调大于2倍的细胞因子有7个(VEGF、DPPIV/CD26、IGF-Ⅰ、IL-17BR、MDC、Pro-MMP-9、Eotaxin-2),处理mDC后上调大于2倍的细胞因子有2个(Eotaxin-2、IL-13)。结论:EVO处理mDC和iDC后,细胞因子的分泌功能发生了明显改变,这些细胞因子影响着DC的抗原摄取、迁移、抗原提呈,为进一步寻找药物靶点提供了线索。     

未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN-γ和IL-12表达的影响

目的:探讨未成熟树突状细胞(DC)对T细胞活化及其IFN-γ和IL-12表达的影响。方法:通过诱导Lewis大鼠骨髓前体细胞,获取未成熟(iDC)和成熟(mDC)两种状态的DC;将两种DC用乙酰胆碱受体(AChR)负载后进行T细胞重复刺激、交叉刺激和无关抗原刺激试验,观察T细胞增殖情况并测定T细胞IFN-γ、IL-12的表达水平。结果:(1)AChR负载的iDC可明显抑制T细胞增殖,且这种被抑制的T细胞对AChR负载的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但对无关抗原OVA负载的mDC的刺激可产生明显增殖。(2)与mDC组比较,AChR负载的iDC初次和重复刺激均明显抑制T细胞IFN-γ和IL-12的表达。结论:iDC可诱导抗原特异性T细胞耐受,耐受机制可能与Th1细胞因子IFN-γ和IL-12的抑制有关。     

未成熟树突状细胞对T细胞功能及其IL-10和TGF-β1表达的影响

目的探讨未成熟树突状细胞(DC)对T细胞功能及其IL-10和TGF-β1表达的影响。方法通过诱导大鼠骨髓前体细胞,获取未成熟(iDC)和成熟(mDC)2种状态的DC;将2种DC用乙酰胆碱受体(AChR)负载后进行T细胞重复刺激、交叉刺激和无关抗原刺激试验,采用MTT法观察T细胞增殖情况,采用RT-PCR方法测定T细胞IL-10 mRNA的表达水平,采用Western blot方法检测T细胞TGF-β1的表达水平。结果①AChR负载的iDC可明显抑制T细胞增殖,且这种被抑制的T细胞对AChR负载的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但对无关抗原OVA负载的mDC的刺激可产生明显增殖。②与mDC组比较,AChR负载的iDC初次和重复刺激均明显增强T细胞IL-10和TGF-β1的表达。结论 iDC可诱导抗原特异性T细胞耐受,耐受机制可能与IL-10和TGF-β1的表达增强有关。     

体外培养人树突状细胞分化成熟特性分析

目的 利用人脐血CD34^＋干细胞诱导分化树突状细胞（DC）,并对DC分化发育过程的生物学特性进行鉴定和分析.方法通过SCF、GM-CSF、TGF-β1、Flt-3L及TNF-α体外培养体系,从脐血CD34^＋造血干细胞中诱导扩增获得DC.采用倒置显微镜和电镜观察DC形态学特征,流式细胞仪检测DC细胞表型及胞内活性氧（ROS）水平,MTT比色法检测DC刺激同种异体T细胞增殖能力;ELISA法检测DC培养上清液中IL-12含量.结果CD34^＋细胞培养5至7 d,细胞呈现DC典型树突状形态,处未成熟状态,再经TNF-α诱导及继续培养至14 d,DC发育成熟.未成熟DC表达模式识别受体CD209（DC-SIGN）,且胞内蓄积适量ROS,具备了细胞吞噬能力.成熟DC除仍高表达DC-SIGN,其表面黏附共刺激分子CDllc、CD54、CD83、CD80、CD86表达上调,细胞因子IL-12分泌增加,且具明显的体外刺激T细胞增殖能力,符合于抗原递呈细胞特征.此外,未成熟和成熟DC基本不表达黏附分子P-、E-选择素,但未成熟和成熟DC分别高表达和低表达L-选择素.结论建立人DC体外模型及其分化发育生物学特性分析,为进一步研究DC功能,以及利用DC调控免疫应答用于疾病防治提供了基础.     

α黑素细胞刺激素基因转染对小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟的影响

为观察转染α黑素细胞刺激素(-αMSH)基因的树突状细胞(DC)的功能和特性,以腺相关病毒(AAV)为载体将α-MSH基因导入小鼠骨髓来源的未成熟DC(-αMSH-DC),用ELISA检测-αMSH-DC培养上清中-αMSH及IL-12水平,用流式细胞仪分析-αMSH-DC表面分子的表达,以-αMSH-DC提呈OVA抗原刺激致敏T细胞,通过ELISA测定IL-2水平来观察其抗原提呈功能。结果显示,在-αMSH-DC培养上清中检测到-αMSH的分泌,-αMSH-DC表面分子表达下调,分泌IL-12的能力降低,抗原提呈功能被抑制。-αMSH-DC可部分抵抗LPS上调表面分子表达和促进IL-12分泌的作用。表明-αMSH基因可籍AAV载体导入未成熟DC,并有效地表达,α-MSH基因修饰的DC成熟受到抑制。     

肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖经EGFR途径诱导支气管上皮细胞分泌细胞因子

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)在肺炎克雷伯杆菌(KP)荚膜多糖(CPS)诱导人正常支气管上皮BEAS-2B细胞分泌炎性细胞因子中的作用。方法:体外培养KP并提取CPS,用不同浓度的CPS刺激BEAS-2B细胞,通过ELISA检测细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)的水平,并于刺激后不同时点通过Western blot检测EGFR的磷酸化水平;EGFR抑制剂AG1478预处理BEAS-2B细胞后,Western blot检测ERK磷酸化水平,间接免疫荧光染色检测p65的核转位,并观察细胞上清中TNF-α和IL-8的变化情况;最后经ERK抑制剂PD98059和NF-κB抑制剂PDTC分别预处理后用CPS刺激细胞,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-8的水平。结果:10 mg/L CPS刺激BEAS-2B细胞12 h能够显著诱导其分泌TNF-α和IL-8;Western blot和间接免疫荧光染色检测结果显示,CPS刺激可显著诱导BEAS-2B细胞中EGFR和ERK的磷酸化及p65的核转位。经EGFR抑制剂AG1478预处理细胞后,ERK的磷酸化水平显著降低,NF-κB的核转位减少;而在EGFR、ERK及NF-κB抑制剂预处理的细胞的上清中,TNF-α和IL-8分泌水平均明显降低(P<0.05)。结论:肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖能够通过EGFR激活ERK和NF-κB信号通路,进而诱导人正常支气管上皮细胞分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-8,提示EGFR可能是KP感染引起炎症反应的关键因子。     

慢病毒载体介导的IL-10诱导耐受性树突状细胞的形成

探讨通过IL-10重组慢病毒载体转染小鼠未成熟树突状细胞(iDC),构建高分泌IL-10的耐受性树突状细胞的可行性.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)联合诱导并经CD11c免疫磁珠分选获得小鼠骨髓iDC,倒置显微镜下观察,流式细胞术分析细胞表面分子:IL-10重组慢病毒载体转染小鼠iD...     

IL-12p35 siRNA干涉对大鼠髓源性DC免疫功能的影响

目的:研究IL-12p35 siRNA干涉对大鼠髓源性树突状细胞(DC)免疫功能的影响.方法:通过粒细胞-巨噬细胞型集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和脂多糖(LPS)体外培养体系,从大鼠骨髓中获得DC,化学合成小型干扰RNA(siRNA),体外转染DC.DC细胞表面分子CD80和MHCⅡ表达采用流式细胞仪分析,检测IL-12p35转录采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测IL-12、IL-10分泌采用ELISA法,细胞递呈抗原能力采用混合淋巴细胞反应(MLR)检测.结果:IL-12p35siRNA转染后的DC表面分子CD80和MHCⅡ表达无明显改变,分泌IL-12减少、分泌IL-10增多,刺激同种T淋巴细胞增殖的能力下降.结论:IL-12p35 siRNA的转染不能干扰DC的成熟,但可以抑制其免疫应答功能.     

microRNA-27a对树突状细胞表型及功能的影响

目的:研究microRNA-27a(miR-27a)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的小鼠树突状细胞(Dendritic cell,DC)的成熟和细胞因子分泌的影响。方法:小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,im DC)转染miR-27a的模拟物(miR-27a mimics)后,用LPS刺激24 h,采用流式细胞仪检测其表面共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ表达,ELISA方法检测其上清中的IL-12p70及IL-10蛋白水平,RT-PCR方法检测其细胞内IL-12p40及IL-10 mRNA水平,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激T细胞增殖能力。结果:与未处理的im DC比较,LPS刺激24 h后的DC表面的共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ表达均显著增高(均P0.001);LPS刺激24 h后,与对照组比较,转染miR-27a mimics细胞的共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ表达均显著降低(均P0.001),且显著抑制IL-12分泌(P0.01)、促进IL-10分泌(P0.05),并显著减弱LPS刺激的DC促CD4+T细胞增殖的能力(P0.01)。结论:miR-27a影响小鼠树突状细胞的成熟以及细胞因子的分泌。