组织工程牙周膜的体外构建**

背景：利用牙周膜干细胞的多向分化潜能修复牙周缺损是近来研究的热点课题。 目的：探讨利用可吸收生物材料冻干胶原膜和犬牙周膜干细胞在体外构建组织工程牙周膜的可行性。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2003-11/2004-10在解放军第四军医大学口腔医院组织工程实验中心完成。 材料：生物膜为冻干胶原膜由解放军第四军医大学口腔医院组织工程实验中心提供。从4只1周岁犬的下颌前牙中分离培养牙周膜干细胞。 方法：取第3代犬牙周膜干细胞扩增至1×107数量级,种植在冻干胶原膜的表面,形成细胞-生物材料复合物,每日更换培养液,倒置相差显微镜动态观察细胞形态和黏附生长状况,体外培养1周左右,组织做扫描电镜、透射电镜和苏木精-伊红染色,观察细胞在冻干胶原膜材料中的生长、增殖以及基质分泌情况。 主要观察指标：①光镜观察细胞接种后生长状况。②电镜和组织学观察细胞支架复合结果。 结果：培养6 d后,犬牙周膜干细胞分泌的基质与支架材料形成网状结构。复合物体外培养1周,细胞黏附在生物支架上,细胞增殖和生长良好,分泌大量基质并形成纤维状结构,细胞复层生长,伸入膜的内部,增殖的细胞和分泌的基质与膜交接成一整体,复合物成为纤维网状组织,基本具备牙周膜的纤维状结构。 结论：利用冻干胶原膜为支架,犬牙周膜干细胞为种子细胞,可在体外成功构建组织工程化牙周膜。     

碱性成纤维细胞生长因子对许旺细胞在小肠黏膜下层支架上黏附及增殖的影响*☆◆

摘要 背景：许旺细胞复合小肠黏膜下层是构建人工神经的可行方法,碱性成纤维细胞生长因子有促进许旺细胞增殖的作用。 目的：验证碱性成纤维细胞生长因子对许旺细胞在小肠黏膜下层支架材料表面的细胞增殖及黏附状态的影响。 方法：将体外分离培养的2代SD乳鼠许旺细胞接种于小肠黏膜下层支架材料上并加入50 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子复合培养为实验组,以单纯的许旺细胞复合小肠黏膜下层作为对照组,分别用MTT法测定细胞增殖能力,细胞黏附率检测细胞在支架上的黏附情况,用流式细胞仪测定细胞分裂周期,并用苏木精-伊红染色及描电镜观察细胞形态及与材料的贴附情况。 结果与结论：MTT显示实验组的细胞增殖吸光度值明显高于对照组(P < 0.05),实验组的细胞黏附率为(69.47±3.17)%,对照组为(44.58±1.76)%(P < 0. 05),细胞周期显示实验组比对照组的G2/M+S期细胞百分含量高(P < 0.05),培养7 d后的苏木精-伊红染色及扫描电镜显示实验组比对照组材料上聚集的细胞数量多,细胞形态伸展更明显,细胞贴附力更好。因此碱性成纤维细胞生长因子可明显地改善许旺细胞在小肠黏膜下层上的增殖及黏附能力,能促进许旺细胞与小肠黏膜下层支架的复合而构建人工神经导管。 关键词：碱性成纤维细胞生长因子;许旺细胞;小肠黏膜下层;增殖;黏附 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.007     

体外三维支架诱导脂肪干细胞向髓核样细胞的分化*

背景：髓核组织工程被认为是椎间盘退变修复的理想方法,种子细胞是髓核组织工程的关键因素,但髓核细胞来源有限。 目的：探讨兔脂肪干细胞在体外三维支架诱导培养条件下能否向髓核样细胞分化。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察,于2008-07/12在解放军北京军区总医院全军骨科研究所完成。 材料：清洁级3月龄日本大耳兔3只,由北京实验动物技术有限公司提供。医用级壳聚糖为浙江金壳生物化学公司产品。 方法：无菌条件下切取兔皮下脂肪组织,胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞。取传至第2代细胞制成细胞悬液50 μL(5×106个细胞),与150 μL壳聚糖-藻酸盐复合物混合,置入12孔板,室温下20 min左右形成凝胶状。设立3组,对照组仅添加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养液2 mL;低氧诱导组、正常氧气诱导组均加入含牛血清白蛋白、转化生长因子β1、地塞米松、维生素C、BMP-7、1% ITS-plus、体积分数为10%胎牛血清的DMEM液,然后分别通气体积分数为2%的O2和20%的O2。各组置入37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养21 d。 主要观察指标：组织形态学观察,蛋白多糖水平,Ⅱ型胶原水平。 结果：扫描电镜显示细胞在支架内正常黏附,细胞绒毛清晰可见,生长状态良好,番红O染色与阿利辛蓝染色均呈阳性,产生较多的蛋白多糖。随时间延长,对照组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均无明显变化;低氧诱导组、正常氧气诱导组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均显著增加,与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.001,P < 0.05);且低氧诱导组产生蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均多于正常氧气诱导组(P < 0.05,P < 0.01)。 结论：在适当的诱导条件下,兔脂肪干细胞在壳聚糖-藻酸盐凝胶支架中可以向髓核样细胞分化,产生与髓核组织相同的细胞外基质,且低氧状态下诱导效果较好。 关键词：脂肪干细胞;组织工程;壳聚糖-藻酸盐凝胶;髓核     

海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞的生物相容性☆

背景：脂肪组织工程研究中,寻找一种优良的生物支架材料作为脂肪干细胞的载体极为重要。 目的：评价兔脂肪干细胞与海绵状Ⅰ型胶原蛋白的生物相容性。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察,于2007-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成。 材料：三四月龄雌性新西兰大白兔8只,由南方医科大学实验动物中心提供。海绵状Ⅰ型胶原蛋白为广州创尔公司产品。 方法：兔麻醉后取颈部皮下脂肪,体外分离培养脂肪干细胞,选取生长良好的第3代细胞,调整密度为1×109 L-1细胞悬液。将无菌的Ⅰ型胶原蛋白海绵裁成10 mm×10 mm×5 mm放入96孔板内,培养液平衡后,每孔支架材料表面接种0.1 mL细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM培养液。 主要观察指标：脂肪干细胞的形态及表面标志表达,细胞在支架材料上的黏附、增殖情况,光镜及电镜下观察细胞-支架复合物。 结果：原代培养的脂肪干细胞形态主要呈宽大扁平短梭形,传代后细胞形态以长梭形为主,第3代脂肪干细胞CD29,CD44免疫荧光染色均呈阳性。细胞与支架混合培养后平均黏附率为92.38%,并保持正常的生长增殖速度。光镜下随培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多,极少从支架材料上掉落,DiI荧光染色后可见细胞膜发出红色荧光。电镜下部分细胞呈团簇状生长,聚集性分布,黏附于胶原海绵表面或孔隙内,细胞周围有大量的基质。 结论：海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,能够为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间,可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。 关键词：组织工程;脂肪干细胞;胶原蛋白;支架;生物相容性;兔     

大鼠脂肪干细胞与细菌纤维素膜的复合培养**◆

背景：国外一些研究表明细菌纤维素作为组织工程支架材料在组织工程方面有很大的应用潜力,但国内在这方面的报道非常少。 目的：以大鼠脂肪干细胞作为组织工程种子细胞,考察其与细菌纤维素复合培养的效果。 设计、时间及地点：观察性实验,于2007-09/2008-08在吉林大学药学院生物工程实验中心和吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科研究所完成。 材料：细菌纤维素膜由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室制备,材料的平均孔径为0.6~2.8 μm,孔隙率为90％。 方法：取3周龄Wistar大鼠腹股沟部脂肪垫,以Ⅱ型胶原酶消化获得大鼠脂肪干细胞,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液进行培养。将处于对数生长期的细胞,以3.0×108 L-1的密度种植于细菌纤维素膜上,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液继续培养,分别于培养的不同时间取细胞-材料复合物,冰冻切片。采用免疫荧光染色方法对生长于细菌纤维素膜上脂肪干细胞的生物学特征进行测定。 主要观察指标：①体外培养大鼠脂肪干细胞形态。②苏木精-伊红染色观察脂肪干细胞在细菌纤维素膜上的生长情况。③免疫荧光染色标记蛋白-CD29在复合物上脂肪干细胞中的表达。 结果：体外原代培养72 h的脂肪干细胞以长梭形为主,7 d后梭形细胞逐渐增多融合,细胞对数生长期为第3~9天。细胞-支架复合物在培养第10天经苏木精-伊红染色后可见细胞呈单层生长于细菌纤维素膜表面,细胞与细菌纤维素膜接触紧密,未见深入细菌纤维素膜内部生长的细胞。免疫荧光技术分析结果表明,标记蛋白-CD29在细菌纤维素膜上的脂肪干细胞有特异性表达。 结论：生长于细菌纤维素膜上的脂肪干细胞不仅能够增殖,而且仍然保持着干细胞的生物学活性。     

碱性成纤维细胞生长因子对离心管内培养骺板细胞生成软骨组织的作用**☆

背景：采用离心管技术体外培养骺板细胞的报道已很多。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对离心管内培养的骺板细胞生成类骺板组织的影响。 方法：获取3周龄新西兰白兔股骨远端的骺板组织，利用组织块纱巾培养法获得骺板细胞，加入含有10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液，连续培养4周。 结果与结论：离心管内聚集的骺板细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液中形成类骺板样组织块。在组织块外周形成类似骺软骨的生发层，中心的骺板细增殖情况良好，向肥大细胞方向分化。类骺板样组织甲苯胺蓝及番红“O”染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性。说明碱性成纤维细胞生长因子能够促进离心管中的骺板细胞形成富含蛋白聚糖及Ⅱ型胶原等细胞外基质的类骺板样软骨组织。     

纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子与大鼠胎肢细胞碱性磷酸酶的活性

摘要 背景：纤维蛋白是一种天然的可生物降解、组织相容性好的高分子材料。碱性成纤维细胞生长因子是一种对中胚层和神经外胚层细胞促分裂作用的多肽生长因子。两者结合有利于干细胞在高度交联的凝胶支架内迁移,并且促进其增殖与分化。 目的：观察纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子对大鼠胎肢细胞碱性磷酸酶活性的影响。 方法：实验分为4组：纤维蛋白凝胶组,纤维蛋白凝胶中加入正常培养基。纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子组,在纤维蛋白凝胶中加入含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养基。碱性成纤维细胞生长因子组,加入10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子培养基。对照组,采用无凝胶正常培养基培养。无菌条件下分离培养大鼠胎肢细胞,取第3代细胞接种于以上培养基中。分别在第3, 5, 7, 14, 21, 28天检测碱性磷酸酶活性、mRNA表达及细胞形态观察。 结果与结论：在有纤维蛋白凝胶组内培养至7 d细胞具有较长突起且连接成网,而在无纤维蛋白凝胶组内的细胞呈纺锤形或立方形;纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子培养7,14,21 d碱性磷酸酶活性高于单纯纤维蛋白凝胶组和单纯碱性成纤维细胞生长因子培养组(P < 0.05)。各时间点纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子组碱性磷酸酶mRNA表达均较对照组增强(P < 0.01)。提示纤维蛋白凝胶复合碱性成纤维细胞生长因子有利于细胞形态发生,并明显增强碱性磷酸酶活性。 关键词：纤维蛋白凝胶;碱性成纤维细胞生长因子;碱性磷酸酶;细胞培养;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.045     

无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细胞与鉴定

背景：最近有研究者采用神经干细胞的无血清培养基从脑肿瘤组织中培养出肿瘤干细胞。 目的：探讨利用无血清培养基从原发胶质母细胞瘤组织中分离培养胶质瘤干细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-08在山东省青岛市脑科研究所完成。 材料：胶质瘤组织来自青岛大学医学院附属医院神经外科手术切除标本,DMEM/F12培养基、B27为GIBCO公司产品,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子为Peprotech公司产品。 方法：无菌条件下取肿瘤深部无坏死囊变、未电凝组织,剪切消化成单细胞悬液后,加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂的无血清DMEM/F12培养基,体外分离培养获得胶质瘤干细胞。待培养孔中细胞团数量增多、培养液刚刚变色时,吸取含有细胞团的培养液进行传代。取第3代胶质瘤干细胞,加入巢蛋白和CD133抗体行免疫荧光检测;加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导5 d,行胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色观察分化情况。 主要观察指标：原代与传代培养的胶质瘤干细胞形态及生长情况,胶质瘤干细胞巢蛋白、CD133的表达及其分化。 结果：原代培养7~10 d可形成大小不一的细胞团,球形或近似球形,呈悬浮或半悬浮状态生长,细胞形态均一,折光性好;传代24 h后次代细胞团形成,细胞的大小、形态与原代无明显差别,连续传代5次后细胞团增殖活跃。第3代胶质瘤干细胞呈巢蛋白和CD133阳性表达,加入胎牛血清后细胞球贴壁分化,呈胶质纤维酸性蛋白阳性。 结论：人脑胶质瘤组织中存在胶质瘤干细胞,在体外无血清条件下可保持未分化的悬浮状态;加入血清后贴壁分化呈胶质瘤细胞样或神经元样,符合干细胞的自我繁殖和多向分化特征。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响

目的：研究已证实，碱性成纤维细胞生长因子刺激牙周膜细胞后可促进人牙周膜细胞的增殖，以利于重建丧失的牙周组织。利用不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子刺激体外培养的人正常牙周膜细胞，观察牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达。 方法：采用胰酶消化法分离培养牙周膜细胞。取第3代对数生长期的细胞，加入含有10%二甲基亚砜和含体积分数20%胎牛血清冻存液的DMEM中进行冻存，第2天移入液氮中保存。免疫组织化学方法行抗波形丝蛋白、角蛋白染色鉴定。取第6代人牙周膜细胞，分为实验组和空白组。实验组分别用含质量浓度为0.1，1，10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液标准条件下培养24 h；空白组用DMEM培养液标准条件下培养24 h。RT-PCR法检测细胞内核心蛋白多糖基因表达变化。 结果：镜下观察空白组细胞未见明显变化，实验组可见细胞增殖，刺激前瓶底细胞较稀疏的区域变得密集了。加入碱性成纤维细胞生长因子的牙周膜细胞内核心蛋白多糖的mRNA表达水平明显下降了，而且随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增加，抑制作用逐渐减弱，在0.1 µg/L时抑制作用最强，在10 µg/L时抑制作用最弱。 结论：碱性成纤维细胞生长因子刺激可促进牙周膜细胞增殖，呈剂量依赖性抑制核心蛋白多糖的合成，0.1 µg/L时抑制作用最强。     

脱细胞猪小肠黏膜下层支架复合软骨细胞构建组织工程软骨*☆

背景：关节软骨损伤后无论是否施加干预,都难以达到满意的修复效果。 目的：观察以猪自体软骨细胞为种子细胞复合脱细胞猪小肠黏膜下层构建组织工程软骨的可行性。 方法：将培养至第3代的猪膝关节软骨细胞接种于小肠黏膜下层膜上,复合培养48 h,构建细胞-载体复合物,光学显微镜、扫描电镜观察软骨细胞在小肠黏膜下层膜上的生长情况。 结果与结论：苏木精-伊红染色见细胞在小肠黏膜下层基质层表面呈单层或复层生长;免疫组织化学染色结果显示软骨细胞与小肠黏膜下层表面之间形成一条连续阳性表达条带;扫描电镜见软骨细胞在支架孔隙内贴壁良好生长。     

40001/间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学研究

背景：大块软骨损伤目前临床上尚无方法治疗,干细胞技术出现后为解决这一难题提供了理论支持。采用新型的支架材料“壳聚糖-胶原蛋白”结合干细胞诱导分化移植给动物模型是一种较新的尝试。 目的：观察壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用软骨诱导分化培养基对P2代细胞进行成软骨诱导。同时制备“壳聚糖-胶原蛋白”支架和兔关节软骨缺损模型。缺损用含有骨髓间充质干细胞的壳聚糖-胶原凝胶填充,另一条关节用没有细胞的支架或不做处理。其中12个关节作为实验组(接受骨髓间充质干细胞+支架),8个关节作为空白对照组(不做处理),8个关节作为单纯支架组(未植入细胞)。造模后于2,4,8,16周进行组织学评分并处死动物行组织学染色。 结果与结论：造模后16周移植的细胞一致分化为软骨细胞,大部分软骨缺损区被新生软骨修复,组织学评分实验组关节修复良好。提示应用骨髓间充质干细胞结合“壳聚糖-胶原蛋白”复合物可以修复关节软骨缺损。 关键词：壳聚糖-胶原凝胶;兔;骨髓间充质干细胞;软骨缺损;组织学变化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.006     

可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架延缓兔骨关节炎软骨退变

背景：纤维蛋白凝胶及脱钙骨基质都有优良的生物相容性及生物降解性,因此可以作为软骨组织工程支架培养软骨种子细胞。这两种材料分别可以作为生长因子的载体缓慢释放生长因子,并达到持续发挥促软骨细胞生长的功能。 目的：验证可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架延缓骨性关节炎的可行性及有效性。 方法：实验为同体对照动物实验。16只兔切断双后肢前交叉韧带制备兔膝关节骨性关节炎模型,兔一侧膝关节内注射复合支架材料与软骨细胞混悬液为实验组。另一侧膝关节内注射等量生理盐水为对照组,12周后取关节软骨,分别进行苏木精-伊红染色,Masson染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色,并根据Wakitani标准及Outerbridge分类重新制定标准进行评分,评价实验组与对照组软骨退变的程度。 结果与结论：实验组关节软骨表面尚光滑,可见软骨陷窝,结构软骨退变较对照组轻;软骨细胞及Ⅱ型胶原较正常软骨组织轻度减少,关节囊组织无明显Ⅱ型胶原表达。实验组综合评分低于对照组(P < 0.01)。表明可注射性纤维蛋白凝胶/脱钙骨基质复合支架为早期骨性关节炎及骨缺损修复提供了一种优良的复合支架材料。 关键词：纤维蛋白凝胶;脱钙骨基质;骨关节炎;软骨;组织工程;兔 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.29.004     

Bio-printing of collagen and VEGF-releasing fibrin gel scaffolds for neural stem cell culture

Time-released delivery of soluble growth factors (GFs) in engineered hydrogel tissue constructs promotes the migration and proliferation of embedded cells, which is an important factor for designing scaffolds that ultimately aim for neural tissue regeneration. We report a tissue engineering technique to print murine neural stem cells (C17.2), collagen hydrogel, and GF (vascular endothelial growth factor: VEGF)-releasing fibrin gel to construct an artificial neural tissue. We examined the morphological changes of the printed C17.2 cells embedded in the collagen and its migration toward the fibrin gel. The cells showed high viability (92.89 ± 2.32%) after printing, which was equivalent to that of manually-plated cells. C17.2 cells printed within 1 mm from the border of VEGF-releasing fibrin gel showed GF-induced changes in their morphology. The cells printed in this range also migrated toward the fibrin gel, with the total migration distance of 102.4 ± 76.1 µm over 3 days. The cells in the control samples (fibrin without the VEGF or VEGF printed directly in collagen) neither proliferated nor migrated. The results demonstrated that bio-printing of VEGF-containing fibrin gel supported sustained release of the GF in the collagen scaffold. The presented method can be gainfully used in the development of three-dimensional (3D) artificial tissue assays and neural tissue regeneration applications.     

Chitosan-collagen porous scaffold and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for ischemic stroke

In this study, we successfully constructed a composite of bone marrow mesenchymal stem cells and a chitosan-collagen scaffold in vitro, transplanted either the composite or bone marrow mesenchymal stem cells alone into the ischemic area in animal models, and compared their effects. At 14 days after co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and the hitosan-collagen scaffold, neurological function recovered noticeably. Vascular endothelial growth factor expression and nestin-labeled neural precursor cells were detected in the ischemic area, surrounding tissue, hippocampal dentate gyrus and subventricular zone. Simultaneously, a high level of expression of glial fibrillary acidic protein and a low level of expression of neuron-specific enolase were visible in Brd U-labeled bone marrow mesenchymal stem cells. These findings suggest that transplantation of a composite of bone marrow mesenchymal stem cells and a chitosan-collagen scaffold has a neuroprotective effect following ischemic stroke.     

Transplantation of nasal olfactory tissue promotes partial recovery in paraplegic adult rats

Recent reports have highlighted the potential therapeutic role of olfactory ensheathing cells for repair of spinal cord injuries. Previously ensheathing cells collected from the olfactory bulbs within the skull were used. In humans a source of these cells for autologous therapy lies in the nasal mucosa where they accompany the axons of the olfactory neurons. The aim of the present study was to test the therapeutic potential of nasal olfactory ensheathing cells for spinal cord repair. Olfactory ensheathing cells cultured from the olfactory lamina propria or pieces of lamina propria from the olfactory mucosa were transplanted into the transected spinal cord. Three to ten weeks later these animals partially recovered movement of their hind limbs and joints which was abolished by a second spinal cord transection. Control rats, receiving collagen matrix, respiratory lamina propria or culture medium, did not recover hind limb movement. Recovery of movement was associated with recovery of spinal reflex circuitry, assessed using the rate-sensitive depression of the H-reflex from an interosseous muscle. Histological analysis of spinal cords grafted with olfactory tissue demonstrated nerve fibres passing through the transection site, serotonin-positive fibres in the spinal cord distal to the transection site, and retrograde labelling of brainstem raphe and gigantocellularis neurons from injections into the distal cord, indicating regeneration of descending pathways. Thus, olfactory lamina propria transplantation promoted partial restoration of function after relatively short recovery periods. This study is particularly significance because it suggests an accessible source of tissue for autologous grafting in human paraplegia.     

不同增稠载体过氧化脲漂白凝胶对口腔黏膜的刺激性☆

背景：牙齿漂白剂影响的部位主要是口腔黏膜及牙体硬组织，课题组前期已进行细胞毒性试验和短期全身毒性试验，参照国家标准YY/T0279-1995中规定的口腔黏膜刺激试验作进一步生物安全性评价。 目的：评价以Carbopol或PVP为增稠载体配制的10%过氧化脲漂白凝胶对口腔黏膜的刺激性，并与同类商品Opalescence漂白剂进行比较。 设计、时间及地点：材料学体外对照观察，于2005-10在解放军第四军医大学口腔医学院材料教研室完成。 材料：60~70 d龄的雄性金色仓鼠30只，颊囊无病变，由兰州生物制品研究所提供。以Carbopol或PVP为增稠载体的10%过氧化脲漂白凝胶由解放军第四军医大学口腔医学院材料教研室配制，进口漂白剂Opalescence为美国Ultradent公司产品。 方法：将直径5 mm的棉片分别浸透3种受试材料：以Carbopol为增稠载体配制的10%过氧化脲漂白凝胶、以PVP为增稠载体配制的10%过氧化脲漂白凝胶、以进口漂白剂Opalescence配制的10%过氧化脲漂白凝胶，每种受试材料取10只大鼠。同时选用新调和的熟石膏作为对照材料。用无创缝线将3种受试材料浸透的棉片随机固定于一侧颊黏膜极低处，将对照材料熟石膏固定于另一侧颊黏膜极低处，24 h后处死。 主要观察指标：大体观察结果，组织学评价。 结果：各组试样均固定良好。与对照组相比，试验组黏膜粗糙，局部轻微充血、肿胀，未见糜烂渗出及溃疡反应，反应程度为轻度。对照材料不具有口腔黏膜刺激性，而3种受试材料均具有口腔黏膜刺激性，组间比较无明显差异。与受试材料接触的颊黏膜上皮完整，角化层增厚；局部上皮细胞轻度增生，黏膜下结缔组织中有少量血管扩张、充血，少量炎性细胞浸润；细胞各层排列整齐，局部出现空泡变性。 结论：以Carbopol或PVP为增稠载体的10%过氧化脲漂白凝胶具有口腔黏膜刺激性，但与临床常用的Opalescence 10%漂白凝胶的刺激性无明显差别，并不会导致组织长期永久性改变。 关键词：口腔黏膜刺激试验；增稠载体；过氧化脲；漂白     

体内环境培养的小口径组织工程血管

背景：人造血管是临床组织修复领域广泛应用的重要器官,但小口径人造血管易于栓塞、难以长期保持通畅,而组织工程血管虽有永久替代作用,培养时间长,不符合血管修复的临床实际。寻找既能及时修复血管、恢复血运,又能在体内形成生物性血管保持长期通畅,是最理想的血管修复重建方法。 目的：观察以改性猪小肠黏膜下层组织为支架,在体内血流条件下培养小口径组织工程血管的可行性。 方法：自犬隐动脉分离出血管内皮细胞、平滑肌细胞,与胶原蛋白凝胶均匀混合,分别种植于小肠黏膜下层膜表面,包绕 3 mm聚乙烯管制成30个3层管状支架,植入犬股动脉缺损处进行桥接吻合为实验组;植入犬皮下组织为对照组。术后进行彩超、组织学检测评价血管的形成过程和免疫组化鉴定。 结果与结论：术后12周,实验组14个血管支架保持通畅,有明显的血管生物结构形成,种子细胞生长增殖良好,管腔有完整内皮细胞覆盖,平滑肌细胞形态、分布良好;对照组管腔结构不完整,种子细胞增殖弱,腔面无内皮细胞覆盖。结果表明通过体内组织工程技术可在血流条件下培养形成小口径组织工程血管。     

携带神经干细胞肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活分化

摘要 背景：多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,肌基膜管具有良好的细胞、组织相容性和降解性,那么能否将二者结合起来构建一个新的神经组织工程支架？ 目的：以神经干细胞为种子细胞,以肌基膜管为支架,观察携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活与分化情况。 方法：体外分离培养大鼠神经干细胞,并进行鉴定。用化学萃取方法制作去细胞骨骼肌基膜管支架,将神经干细胞移植入肌基膜管支架培养7 d后,用免疫组织化学方法检测神经干细胞的存活及分化情况,扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：神经干细胞分离培养第5天,Nestin免疫荧光染色可见大量神经球。加血清诱导神经干细胞分化至7 d,进行抗NF、抗GFAP免疫荧光染色,镜下可见NF、GFAP阳性细胞,证明培养的神经干细胞具有多项分化潜能。苏木精-伊红染色法显示肌基膜管中肌细胞成分已消失,肌基膜管支架内主要是大致平行的管道。携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架免疫荧光染色证明,神经干细胞在支架内仍具有干细胞特性,并可分化为神经元和神经胶质细胞。扫描电镜显示神经干细胞可以稳固地贴附在肌基膜管内,提示制备的神经组织工程支架具有良好的生物相容性,可以进行体内移植治疗脊髓损伤等神经系统疾病。 关键词：肌基膜管;组织工程支架;神经干细胞;移植;脊髓损伤 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.003     

胶原蛋白硫酸肝素支架移植入猪脑后对其神经元凋亡的影响

本实验研究胶原蛋白硫酸肝素支架移植入猪脑后对其神经元凋亡的影响,测定体内试验中该支架和 猪脑组织的生物相容性。实验组通过微创手术将胶原蛋白硫酸肝素支架移植入猪的脑内。对照组行假手术。分别于术后1天、3天、7天、14天或者30天手术处死动物,取组织标本行组织学分析（包括免疫组织化学法检测Bax 和Bcl-2）。HE染色发现移植后随即出现轻度组织反应。通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记分析法于术后第1、3、7、14天在两组动物脑组织中都发现小量凋亡细胞;但是Bax 和Bcl-2呈低表达。在术后3天和7天,实验组和对照组间有显著差异,但是在术后30天两组间差异不明显。该支架和猪的脑组织具有组织相容性,能作为生物学底物安全地用于中枢神经系统组织工程。