龙胆泻肝汤对葡萄膜炎大鼠Notch信号通路的干预作用

目的　探讨龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis,EAU）大鼠Notch信号通路相关基因表达的影响。方法　Lewis大鼠用随机数字表法分为正常对照组、EAU模型组和龙胆泻肝汤干预组,后两组诱导EAU模型,龙胆泻肝汤干预组造模后用龙胆泻肝汤灌胃。免疫后12 d分别分离三组大鼠的脾脏和淋巴结收集CD4⁺T细胞,流式细胞仪检测Th17、Treg细胞的表达水平;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测Notch1、Notch2、Notch3、Notch4基因的表达情况;ELISA检测Notch信号通路相关蛋白的表达水平。结果　流式细胞仪检测发现,与正常对照组相比,EAU模型组大鼠脾脏和淋巴结中Th17细胞水平明显升高,Treg细胞水平降低;与EAU模型组相比,龙胆泻肝汤干预组大鼠的Th17细胞水平明显下降,Treg细胞水平升高,两者比例逐渐恢复均衡;qRT-PCR检测发现龙胆泻肝汤干预组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4基因的表达在免疫后12 d高于正常对照组（均为P<0.01）,但显著低于EAU模型组（均为P<0.01）,Notch3基因在大鼠脾脏和淋巴结未检测到表达;ELISA检测结果发现,龙胆泻肝汤干预组大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2和Notch4蛋白表达水平在免疫后12 d虽然高于正常对照组（均为P<0.01）,但显著低于EAU模型组大鼠（均为P<0.01）。结论　龙胆泻肝汤可有效缓解EAU大鼠中Th17/Treg比例失衡状态,其作用机制可能涉及到Notch信号通路调节的nave CD4⁺T细胞向Th17 和Treg细胞的分化。     

龙胆泻肝汤抑制Notch信号通路活化对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠Th1、Th2细胞分化的影响

目的　探讨龙胆泻肝汤（LXD）对Notch信号通路活化的抑制作用及其对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠Th1、Th2细胞分化的影响。方法　将30只Lewis大鼠随机分为正常对照组、EAU模型组和LXD干预组,其中EAU模型组、LXD干预组大鼠均诱导EAU,LXD干预组大鼠造模后使用LXD每天灌胃处理,EAU模型组和正常对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃。干预后12 d分离三组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织,Q-PCR检测Rbpj基因的表达,ELISA检测Rbpj、γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）蛋白的表达,流式细胞仪检测各组织中Th1、Th2细胞的表达水平,分析Th1/Th2细胞比例的变化。结果　干预后12 d,Q-PCR检测发现,与正常对照组大鼠相比, Rbpj mRNA在EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中均呈显著上调表达(均为P<0.001);与EAU模型组相比,LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj mRNA相对表达水平均显著降低(均为P<0.01)。ELISA检测结果发现,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj和IFN-γ蛋白表达水平均明显高于正常对照组,IL-4蛋白表达水平均明显低于正常对照组（均为P＜0.05);相比于EAU模型组,LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结以及眼组织中Rbpj IFN-γ蛋白表达水平均显著降低,IL-4蛋白表达水平均显著升高（均为P＜0.05)。流式细胞仪检测发现,与正常对照组相比,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th1细胞水平均明显升高,Th2细胞水平均明显降低,Th1/Th2细胞比例失衡（均为P＜0.05）;与EAU模型组相比,LXD干预组大鼠各组织中Th1细胞水平均明显下降,Th2细胞水平均明显升高,两者细胞比例逐渐恢复均衡（均为P<0.01)。结论　LXD可通过下调EAU大鼠Notch信号通路转录因子Rbpj的表达水平抑制Notch信号通路的活化,显著促进EAU大鼠中Th1/Th2细胞比例恢复平衡并改善免疫微环境,从而达到治疗葡萄膜炎的目的。     

龙胆泻肝汤对葡萄膜炎大鼠关键炎症细胞因子表达的影响

目的 探讨龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠关键炎症细胞因子表达的影响.方法 Lewis大鼠随机分为对照组(6只)、EAU组(18只)和LXT组(18只).光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)免疫EAU组和LXT组大鼠,对照组大鼠注射等量不含IRBP的乳化液.使用实时荧光定量PCR及ELISA方法检测血液、淋巴结和脾脏中IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-10细胞因子在EAU大鼠体内治疗前后的变化情况.结果 LXT组大鼠全血中IFN-γ mRNA表达在第8天虽然高于对照组(P=0.000),但已显著低于EAU组(P=0.000);LXT组IL-17 mRNA在第12天达峰值,显著低于EAU组(P=0.000),且均显著高于对照组(P=0.000);TNF-α mRNA仅在第12天显著高于对照组(P=0.000),但低于EAU组(p=0.000);IL-10 mRNA表达在第16天高于EAU组(P =0.042).LXT组大鼠淋巴结和脾脏中IFN-y、IL-17和TNF-α mRNA表达在第12天显著低于EAU组(均为P =0.000);LXT组淋巴结中IL-10 mRNA表达在第8天开始显著高于对照组(P=0.001),且在整个炎症期均维持在较高水平;LXT组脾脏IL-10 mRNA表达在第12天达峰值,且高于对照组和EAU组(均为P=0.000).LXT组大鼠血清中IFN-y、IL-17和TNF-α蛋白表达水平在第12天和第16天均低于EAU组(均为P＜0.05);EAU组和LXT组血清中IL-10蛋白表达在第12天均高于对照组(均为P ＜0.05),第16天达峰值,但LXT组IL-10蛋白含量更高.结论 龙胆泻肝汤通过抑制IFN-γ、IL-17和TNF-oα相关炎症因子的表达发挥其抗炎作用,促进IL-10的表达,加速自身免疫炎症的恢复.龙胆泻肝汤可通过多种途径在EAU的治疗中发挥免疫调节作用.     

龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠补体C4、MBL2表达的影响

目的探讨龙胆泻肝汤(Longdan Xiegan decoction,LXD)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠的治疗作用及对血清中C4、MBL2蛋白表达水平的影响。方法 54只Lewis大鼠用随机数字表法分为正常对照组、EAU组和LXD组,其中EAU组、LXD组大鼠制备EAU模型,LXD组造模后使用LXD每天灌胃处理,EAU组给予等量生理盐水灌胃。免疫后12 d使用激光扫描检眼镜(scanning laser ophthalmoscope,SLO)观察三组大鼠眼底炎症,并取三组大鼠同侧眼球进行病理切片,观察视网膜组织病理学变化;分离三组大鼠的脾脏和淋巴结,收集T淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4⁺/CD8⁺细胞比例的变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中C4、MBL2蛋白的表达水平。结果 SLO检查结果显示,与正常对照组相比,EAU组大鼠屈光间质不清,无法观察眼底视网膜及血管情况;LXD组大鼠眼底血管...     

龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的　探讨龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏ-ｉｍｍｕｎｅｕｖｅｉｔｉｓ,ＥＡＵ）的治疗作用。方法　Ｌｅｗｉｓ大鼠随机分为对照组６只、ＥＡＵ组１８只和ＬＸＴ组１８只,光感受器间维生素Ａ结合蛋白免疫ＥＡＵ组和ＬＸＴ组大鼠。观察大鼠生理特征及眼部炎症变化,出现葡萄膜炎症时给予ＬＸＴ组大鼠龙胆泻肝汤灌胃;免疫后１２ｄ比较各组大鼠眼组织病理学差异;免疫后每隔４ｄ检测房水蛋白及血清中白蛋白、球蛋白变化。结果　成功制备了ＥＡＵ大鼠模型;免疫后５ｄ大鼠开始出现葡萄膜炎症状,１２ｄ炎症最重。ＥＡＵ大鼠肛温在１ｄ、７ｄ、１０ｄ和１２ｄ高于对照组（Ｐ＝０．０２０、０．０００、０.０１５、０．００１）;免疫后１２ｄ,ＥＡＵ组房水蛋白浓度为（３６．０３±３．２３）ｇ?Ｌ－１,ＬＸＴ组为（２４．６７±２．６０）ｇ?Ｌ－１,差异有显著统计学意义（Ｐ＝０．０００）;组织病理学显示ＥＡＵ组视网膜结构破坏程度明显高于ＬＸＴ组（Ｐ＝０．０００）。ＥＡＵ组免疫后４ｄ、８ｄ及１２ｄ白蛋白均低于对照组（Ｐ＝０．０４５、０．０００、０.０３３）,ＬＸＴ组４ｄ和８ｄ白蛋白低于正常（Ｐ＝０.０４５、０．００５）,但１２ｄ时恢复至正常;１２ｄ时ＥＡＵ组球蛋白明显高于正常（Ｐ＝０．０４７）,ＬＸＴ组未见明显异常。结论　龙胆泻肝汤能有效减轻ＥＡＵ大鼠前房炎症,减少炎症细胞浸润,保护眼部组织结构,增强机体抗氧化能力,调节免疫状态,对ＥＡＵ发挥治疗作用。     

miR-30b-5p 抑制Notch信号通路活化对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的　探讨miR-30b-5p对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠Notch信号通路活化的调控机制及治疗作用。方法　通过Target Scan（http://www.targetscan.org/）对Notch1和Dll4基因与 miR-30b 的关系进行生物信息学预测。将雌性Lewis大鼠随机分为对照组、EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p空载体（miR-30b-5p-N）组。EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠首先诱导EAU模型,miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠分别采用携带miR-30b-5p和miR-30b-5p-N的慢病毒于EAU大鼠脾脏进行注射干预处理,EAU组大鼠于同一部位注射相同体积的生理盐水。处理后12 d,实时荧光定量PCR检测4组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA的表达;免疫组织化学检测4组大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中Notch1和Dll4蛋白的表达,分析miR-30b-5p对葡萄膜炎大鼠Notch信号通路的调控作用。结果　生物信息学预测分析结果表明,Notch 信号通路上 Notch1和Dll4基因均为 miR-30b 调控的靶基因。免疫后12 d,相比于对照组,EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA水平均升高（均为P<0.05）;经miR-30b-5p干预治疗后,miR-30b-5p组脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 mRNA表达均显著降低（均为P<0.05）。免疫组织化学检测结果显示,免疫后12 d,EAU组、miR-30b-5p组和miR-30b-5p-N组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4 蛋白表达均上调（均为P<0.05）;miR-30b-5p干预治疗后,脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白表达均显著下调（均为P<0.05）。结论　miR-30b-5p可明显下调EAU大鼠各组织中Notch1和Dll4等Notch信号通路相关分子的表达进而抑制Notch信号通路活化,从而达到治疗葡萄膜炎的作用。     

龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的调控作用

目的 探讨龙胆泻肝汤(Longdan Xiegan decoction,LXD)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的调控作用.方法 将48只雌性Lewis大鼠随机分为正常对照组、EAU模型组和LXD干预组,其中EAU模型组和LXD干预组大鼠首先诱导并建立EAU模型,LXD干预组大鼠每天给...     

Th1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠中的表达及作用

目的　探讨辅助性Ｔ细胞（Ｔｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓ,Ｔｈ）１、Ｔｈ１７细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｕｖｅｉｔｉｓ,ＥＡＵ）中的表达及作用。方法　取清洁级纯系健康雌性Ｌｅｗｉｓ大鼠４０只随机分为ＥＡＵ组（３２只）和对照组（８只）,ＥＡＵ组用光感受器间维生素Ａ类结合蛋白诱导大鼠ＥＡＵ模型,进行临床症状评分,免疫组织化学方法检测造模后视网膜内干扰素（ｉｎｆｅｒｆｅｒｏｎ,ＩＦＮ）-γ、诱导型一氧化氮合酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ,ｉＮＯＳ）、白细胞介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ,ＩＬ）-１７、ＩＬ-６的表达。ＥＬＩＳＡ法对比分析房水中各细胞因子的变化情况。结果　ＥＡＵ模型建立成功;造模后第１４天,视网膜损害以外层为主,视网膜内有大量炎细胞浸润,从而导致视网膜内结构紊乱,同时在视网膜的视锥、视杆细胞层和神经节细胞层ｉＮＯＳ、ＩＬ-１７、ＩＬ-６、ＩＦＮ-γ表达,细胞阳性率分别为２９％、４８％、５２％、７３％。在ＥＡＵ发病过程中,ＩＬ-６于造模后第７天迅速升高,第１０天达到高峰;ＩＬ-１７于造模后第１４天达到最高值,变化趋势与炎症进程一致;ＩＦＮ-γ在炎症后期仍有升高,于造模后第１６天达到最高值;ＩＬ-６、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γ与对照组相比,各时间点表达差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ｉＮＯＳ在炎症进程中表达有所增加,但与对照组相比,各时间点的表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。结论　Ｔｈ１、Ｔｈ１７细胞相关因子调节网络共同参与实验性自身免疫性葡萄膜炎的发生发展。     

基于网络药理学和生物信息学探讨龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎的分子机制

目的：探讨龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎的药效学研究和分子机制分析。方法：实验研究。在体实验验证龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎的疗效,利用中药网络药理学数据和分析平台查询并筛选复方龙胆泻肝汤的入血有效成分,并进行网络拓扑分析其可能的治疗靶点。通过查询多种已知疾病靶点数据库,筛选葡萄膜炎的治疗靶点,并与有效成分治疗靶点构建出有效成分-疾病治疗靶点网络,并筛选出关键节点;拓扑分析关键节点参与的信号通路并进行富集分析,筛选出中药复方龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎的可能信号通路。结果：在体实验结果证实龙胆泻肝汤能够减轻大鼠结膜充血、虹膜粘连,减轻前房、睫状体和视网膜炎症细胞浸润,具有治疗葡萄膜炎的的作用;网络药理学分析显示龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎主要通过MAPK信号通路、促性腺激素信号通路和雌激素信号通路,减少炎症因子的产生和细胞浸润,调节机体免疫状况,调控葡萄膜炎的发生发展。结论：龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎可能主要是通过MAPK信号通路、促性腺激素信号通路和雌激素信号通路,调控炎症细胞和炎症因子、自身免疫等来实现。     

调节性T细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的作用

目的探讨CD4^＋调节性T细胞（Treg）在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）病程进展中的作用。方法通过IRBP161-180和完全弗氏佐剂皮下免疫,在B10RⅢ小鼠诱导产生EAU,对眼内炎症行临床检查并对其严重程度予以评分。通过免疫磁珠分选EAU恢复期小鼠脾脏CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、CD4^＋CD25^＋T细胞和CD4^＋CD25^-T细胞。通过流式细胞术分析脾脏CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞的比例。通过体内过继转移评价Treg的抑制效应。结果小鼠诱导EAU后产生眼内炎症反应。将EAU恢复期小鼠脾细胞、脾CD4＋T细胞或脾CD4^＋CD25^＋T细胞过继转移入正常小鼠继而皮下免疫诱导EAU,眼底检查显示受者小鼠眼内炎症程度明显降低。相反,正常小鼠脾细胞、EAU恢复期脾CD8^＋T细胞或CD4^＋CD25^-T细胞过继转移无此效应。流式细胞分析显示随着EAU的发展,脾内CD4^＋CD25^＋T细胞比例和CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞比例逐步升高,并在恢复期维持较高水平。结论 CD4^＋Treg随着EAU的病程进展数量增多,它们可能参与EAU的自发缓解。     

rno-miR-30b-5p对葡萄膜炎大鼠Notch1和Dll4基因表达的调控作用

目的　探讨rno-miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用及其在实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis,EAU）中的表达变化。方法　应用双荧光素酶检测rno-miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用。6~8周龄健康Lewis大鼠12只,随机分为对照组和EAU模型组,EAU模型组大鼠建立EAU模型。于免疫后12 d分离大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织,Q-PCR检测rno-miR-30b-5p、Notch1和Dll4基因的表达水平,ELISA检测Notch1和Dll4蛋白的表达变化;流式细胞仪检测两组大鼠脾脏和淋巴结中Th17和Treg细胞的表达水平。结果　双荧光素酶检测结果表明,Notch1和Dll4为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。Q-PCR分析结果显示,相比于正常对照组（1.00）,免疫后12 d,rno-miR-30b-5p基因在EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中的相对表达水平分别为0.41±0.12、0.37±0.09和0.25±0.07,均呈显著下调表达,而Notch1和Dll4基因呈显著上调表达,且差异均有统计学意义（均为P<0.05）。ELISA检测结果显示,免疫后12 d,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白的表达水平均明显高于对照组（均为P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,免疫后12 d,EAU模型组大鼠脾脏和淋巴结中Th17细胞因子的表达水平明显升高,而Treg细胞因子的表达水平明显降低。结论　rno-miR-30b-5p可负调控Notch1和Dll4基因的表达。在EAU模型大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织中,rno-miR-30b-5p的下调表达可使Notch1和Dll4基因的表达水平显著升高,并使Th17/Treg比例发生紊乱,从而影响葡萄膜炎的发生发展。     

实验性自身免疫性葡萄膜炎T淋巴细胞亚群与Treg细胞的表达研究

目的　探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｕｖｅｉｔｉｓ,ＥＡＵ）新西兰兔模型外周血单个核细胞（ｐｅ-ｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ,ＰＢＭＣ）Ｔ淋巴细胞亚群的变化及其与疾病特征的相关性。方法　选取健康成年雄性新西兰大白兔４０只作为动物模型,用２０ｇ·Ｌ－１牛血清蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ,ＢＳＡ）静脉注射和玻璃体内注射法建立ＥＡＵ模型,并观察模型眼炎症反应及ＰＢＭＣＴ淋巴细胞亚群特征。结果　ＣＤ４＋Ｔ细胞在ＥＡＵ兔的外周血中比例明显增加,且随时间的进展呈进行性增加,并与炎症反应呈正相关,相同的趋势可见于ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ细胞比例。此外,Ｔｒｅｇ细胞趋势与ＣＤ４＋Ｔ细胞及ＣＤ４＋Ｔ／ＣＤ８＋Ｔ细胞比例相反,与炎症反应呈负相关。结论　ＣＤ４＋Ｔ细胞的优势性选择性克隆增殖及Ｔｒｅｇ细胞的降低有可能引发免疫功能紊乱并导致针对自身组织的免疫应答失去有效的负性调控,导致ＥＡＵ的发生及进行性加重。     

短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎发展的作用

目的 探索短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)发展的促进作用.方法 选取健康SPF级6～8周龄小鼠38只,随机分为模型对照组(EAU组)和高糖模型组(GLU组),每组19只小鼠.GLU组小鼠从造模前14 d开始给予200 g·L-1葡萄糖溶液饮水直至处死,EAU组小鼠给予正常饮水,同时保证EAU...