烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

烟草黄瓜花叶病毒抗性位点发掘

烟草黄瓜花叶病毒（CMV）是烟草生产中主要病害之一,发掘其抗性位点,培育抗病品种是最有效的策略之一。本研究利用高抗CMV烤烟品种台烟8号为轮回亲本,优质感病烤烟品种NC82为供体亲本,配置BC1F1群体。在此基础上,利用组织快繁技术对200份BC1F1群体进行快繁,苗期人工接种CMV,获得稳定、可靠的表型数据。利用SSR标记构建遗传图谱,进而利用单向方差分析和完备复合区间作图法发掘CMV抗性位点。结果表明,单向方差分析法分别检测到5个与发病率性状和病情指数性状相关的标记;完备复合区间法共定位到5个QTL,其中2个与发病率性状相关,3个与病情指数性状相关。相关定位结果对开展分子育种辅助改良烟草CMV抗性具有一定意义。     

快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ－ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ－ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ     

烟草与黄瓜花叶病毒互作中过氧化氢酶活性的变化

研究了12个不同抗性水平的烟草品种接种黄瓜花叶病毒前后过氧化氢酶活性的动态变化及其与烟草抗病性的关系。结果表明,接种病毒后抗、感品种的过氧化氢酶活性总体水平比对照降低,但酶活性的动态变化规律与烟草抗病性之间的相关性并不显著。利用DPS数据处理系统分析表明:酶活性变化差值及其平均值与病情指数之间均不存在显著相关性,说明以接种前后植物体内酶活性的变化值作为抗病性鉴定的指标在烟草-黄瓜花叶病毒体系中是不可行的。     

转录后基因沉默(PTGS)与烟草抗病毒育种

对转录后基因沉默的特点和发生机制、PTGS与植物病毒抗性等方面进行综述,并在此基础上,就该技术策略应用于烟草抗病毒育种上的可行性进行探讨,并提出相关建议。      

抗马铃薯Y病毒(PVY)和烟草花叶病毒(TMV)单联弱毒疫苗的研制及防效测定

为防治烟草马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）,筛选PVY和TMV基因组中保守且高效表达siRNA的片段,连接到烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）弱毒侵染性克隆,制备成单联弱毒疫苗,获得TVB-PVYF1、TVB-PVYF2、TVB-PVYF3和TVB-TMVF1、TVB-TMVF2、TVB-TMVF3共6个单联弱毒疫苗。室内筛选后选取保护效果最好的TVB-PVYF2和TVB-TMVF3两个单联弱毒疫苗在山东临沂、潍坊和黑龙江哈尔滨等地进行了田间防效测定,TVB-PVYF2对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草PVY的相对防效分别为66.88%、76.46%和60.71%,TVB-TMVF3对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草TMV的相对防效分别为80.74%、87.34%和74.40%。      

快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ—ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ—ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ８９品系及未转化的对照ＮＣ８９进行了比较。结果表明，同时表达ＣＭＶ外壳蛋白和卫星ＲＮＡ的双单倍体转基因植株，在Ｒ—１代即表现出一致的可稳定遗传的ＣＭＶ抗性，抗性水平较单独表达ＣＰ或Ｓａｔ—ＲＮＡ的转基因ＮＣ８９提高１倍左右。     

引起生物转基因沉默的因素、作用和对策

基因沉默是生物体基因表达调控的一种重要的机制,它具有重要生物学功能,转基因沉默是导致外源基因不能在生物体中正常表大的主要原因,并已成为转基因植物商品化生产的严重阻碍。本文就基因沉默的机制作了简要综述,并对基因沉默在生物生长发育中的作用及如何消除植物中外源因沉默,促使其高效表达的策略进行了初步的探讨。     

拮抗细菌对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究

从发生烟草花叶病毒(TMV)的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株By33和By88。生物测定试验表明,By33和By88的无菌发酵液对TMV的体外抑制作用分别为81.81%和83.29%,涂抹菌液24 h后接种TMV,仍有73.01%和66.98%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白;拮抗蛋白对TMV的体外抑制作用分别为85.38%和87.47%,并且在274.00 nm处有明显的蛋白吸收峰,为典型的蛋白质吸收光谱。此外,通过叶圆片法和透析法生物测定表明,抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆,有抑制TMV在烟株体内复制的作用。     

某些因素对烤烟病毒病(PVY、CMV、TMV)发病程度的影响调查

１９９６年在河南省宝丰县、襄城县和叶县，花叶病普遍较常年严重，故此对２０种类型烤烟大田的病毒病（ＰＶＹ、ＣＭＶ、ＴＭＶ）发病率和病情指数进行了调查。每种因素两种类型烟田的病毒病发病率差异和病情指数差异用新复全距法（ＳＳＲ）进行检验。结果表明，麦烟套种、地膜覆盖、距公路较远种烟和轮作显著减轻病毒病；ＮＣ８９烟田和砂质土烟田分别比Ｇ８０、Ｋ３２６烟田和粘质土烟田病毒病显著减轻；幼苗剪叶、土施微肥（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｂ）、移栽相对早晚和浇水相对早晚对烤烟病毒病发病程度无显著影响。     

烟草腺毛优势表达基因NtMYB108b的克隆及分析

为揭示NtMYB108转录因子在烟草中的功能,从栽培烟草K326的叶片腺毛中克隆到1条MYB基因的全长cDNA序列,命名为NtMYB108b。NtMYB108b的开放阅读框为828 bp,编码275个氨基酸。生物信息学预测显示,NtMYB108b蛋白定位于细胞核,属于R2R3-MYB型转录因子S20亚组成员,与绒毛状烟草亲缘关系最近,序列相似性为100.00%。实时荧光定量PCR分析显示,NtMYB108b在烟草腺毛中优势表达;NtMYB108b在团棵期叶片中相对表达量最高,在现蕾期5个叶位中的表达无显著差异。经乙烯利（ET）和水杨酸（SA）处理后,NtMYB108b的表达量显著上调,而经茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）处理后其表达量无显著变化;使用聚乙二醇（PEG）处理模拟干旱胁迫,处理2 d后NtMYB108b表达量上调,这说明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信号转导和干旱胁迫。     

基于钝齿棒杆菌argGH启动子改造的L-瓜氨酸高效合成

L-瓜氨酸是尿素循环的重要中间体,在argGH编码酶的催化下易分解为L-精氨酸,在微生物体内难以大量积累。作者通过启动子替换手段,以弱启动子P-dapAB6替换调控argGH表达的启动子P-argG,构建了弱化L-瓜氨酸分解代谢途径的重组菌株Corynebacterium crenatum H-7-PdapAB6:argGH。重组菌株的转录水平和酶活力结果显示,重组菌株分解途径中argG和argH的基因表达水平下调,精胺琥珀酸合成酶ASS(argG编码)和精胺琥珀酸裂解酶ASL(argH编码)酶活分别降低91.80%和55.35%。摇瓶发酵结果表明,L-瓜氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度分别为33.85 g/L、0.25 g/g和0.34 g/(L·h),较原始菌株分别提高了4.91、5.00和4.86倍。通过启动子替换策略,构建了L-瓜氨酸分解代谢途径弱化的工程菌株,初步实现了L-瓜氨酸的高效合成。     

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

新鉴定高抗TMV普通烟草枯斑资源的N导入片段长度多样性

为了解我国普通烟草（Nicotiana tabacum）资源对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的抗性基因状况,为烟草抗病育种的亲本选择提供信息,利用N基因特异分子标记鉴定出携带N基因的普通烟草资源,并采用N导入片段的特异分子标记鉴定了N导入片段的长度。结果表明,供试的63份接种TMV表现枯斑的普通烟草（简称普通烟草枯斑资源）可划分为3大类型,分别为Coker176类型:GL3.50和GL4.06标记阴性、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性;Samsun NN类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226标记阳性,TN5.51阴性;Xanthi nc类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性。402等51份资源的N导入片段长度属于Coker176类型,Ky160等2份资源的N导入片段长度属于Samsun NN类型。Ky52等10份资源的N导入片段长度属于Xanthi nc类型。N导入片段较短的枯斑资源,推测其连锁累赘可能较小,育种利用潜力较大。本文较系统地鉴定了普通烟草抗TMV的枯斑资源的N导入片段长度,可为抗TMV种质资源的育种利用提供参考。      

南方根结线虫侵染烟草抗感品种前后的代谢组学分析

为明确南方根结线虫侵染烟草抗感品种前后代谢途径的差异,选取烟草抗病品种G28与感病品种长脖黄壮苗为试验材料,设置4个处理:1）G28接种J2s悬浮液（G_RKN）;2）长脖黄接种J2s悬浮液（C_RKN）;3）G28接种清水（G_CK）;4）长脖黄接种清水（C_CK）。每个处理3次重复。采用LC/MS技术分析接种前后代谢通路的变化。结果表明,南方根结线虫侵染的抗、感病品种G28与长脖黄在抗病相关的代谢通路都有明显变化,鉴定出的差异代谢物包括了生物碱、脂肪酸、类黄酮、萜类和聚酮等物质。其中抗病品种被显著激活的代谢通路有10条,而感病品种只有5条。所以抗、感品种被南方根结线虫侵染后防御能力不同。      

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

NtSPX4基因敲除对烟草苗期磷吸收和生长发育的影响研究

[目的]为探究NtSPX4基因在烟草磷吸收转运中的作用.[方法]同源克隆了烟草(Nicotiana tabacum L.)K326中NtSPX4基因,通过CRISPR/Cas9技术获得了NtSPX4-1和NtSPX4-2均发生纯合突变的K326株系S42,在不同磷浓度的Hoagland溶液培养条件下,对S42株系的生长...     

利用LC-MS技术解析黑果枸杞、红果枸杞代谢物的差异

为了分析比较黑果枸杞和红果枸杞代谢物的差异.利用液相色谱质谱联用技术(LC-MS)分析其代谢产物,共检测出6 982种代谢物,包括负离子2 704个,正离子4 278个;主成分分析(PCA)分析发现,黑果枸杞和红果枸杞可以被区分开;对差异代谢物的分析发现,二者共有501种差异代谢物,其中表达量前50的差异代谢物中有7种...     

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

抗赤星病烟草的防卫基因的表达与基因组DNA结构的变化

用赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）毒性菌株产生的ＡＴ毒素诱导烟草,可使寄主获得对赤星病８０．４％的系统抗性,比病菌弱毒株ＴＢＡ１６孢子诱导的效果高约２０％。烟草品种ＮＣ８９心叶叶碟在含ＡＴ毒素６０％和７０％的ＭＳ培养基上经２轮胁迫筛选和植株再生,得到抗病品系ＮＣ８９－ＴＴ。用５种防卫基因的ｃＤＮＡ探针检测了不诱导、受ＡＴ毒素诱导、受病菌弱毒株激发子诱导的ＮＣ８９和诱导与不诱导的ＮＣ８９－ＴＴ第４代植株５种基因的转录活性,结果表明,苯丙氨酸氨裂解酶（ＰＡＬ）基因在ＮＣ８９中不能组成型表达,可被ＡＴ毒素诱导激活,但不受激发子诱导;病程相关蛋白（ＰＲ蛋白）ＰＲ－ｌａ、查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、脂氧合酶（ＬＯＸ）基因在ＮＣ８９中表现为诱导转录或诱导后转录活性增强;这４种基因都在ＮＣ８９－ＴＴ中组成型表达