新趋化因子VCC-1小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建对VCC-1基因有特异性抑制作用的小干扰RNA(siRNA)表达载体.方法 根据VCC-1 mRNA序列,按照siRNA设计原则设计4条特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中.酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染SMMC7721细胞,以RT-PCR分析其对VCC-1 mRNA表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.pGPU6/GFP/Neo-siRNA、B、C、D载体均能抑制SMMC7721细胞VCC-1基因mRNA的表达,其中重组质粒C抑制作用最强.结论 成功构建了靶向人VCC-1的小干扰RNA表达载体,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础.     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

乙酰肝素酶基因靶向特异性RNA干扰重组表达载体的构建及筛选

目的 构建对人乙酰肝素酶(HPA)基因有特异性抑制作用的短发夹状RNA表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的人HPA基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染人MDA-MB-231细胞,分别以荧光定量PCR、Western blot分析其对HPA在mRNA水平和蛋白质水平上表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.在构建的5个载体中,HPSE-1组及HPSE-5组中MDA-MB-231细胞HPA基因mRNA和蛋白质表达水平明显下降,而对照组未发生明显改变.结论 成功构建了2个靶向人HPA的shRNA表达载体,转染MDA-MB-231细胞后可高效抑制HPA基因表达,为进一步研究HPA的表达与乳腺癌迁移和侵袭的机制奠定了基础.     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

NgR特异性siRNA筛选及其慢病毒表达载体构建

目的:筛选出高效的NgR(Nogo受体)特异性siRNA,并构建其慢病毒表达载体。方法:按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA;将获得的高沉默效率siRNA克隆入慢病毒质粒pRNAT—U6.2/Lenti(SD1259),构建NgR特异性siRNA慢病毒表达载体,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果:在4对siRNA中筛选出高沉默效率的NgR特异性siRNA199序列,将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建成NgR特异性siRNA199表达载体,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论:NgR特异性siRNA199及其慢病毒表达载体构建成功,为进一步观察NgR特异性慢病毒载体RNA干扰抑制大鼠NgR mRNA表达的神经元细胞实验奠定了基础。     

针对livin的siRNA表达载体的构建

目的设计能够有效抑制livin基因表达的小干扰RNA,构建针对livin基因的siRNA重组表达载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的一组寡核苷酸片段,克隆到pSilencerTM3．1-H1hygro载体,并经BamHI／EeoRI双酶切及测序鉴定证实,livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体中。结果经BarnHI／EcoRI双酶切及测序鉴定证实,人livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体pSilencerTM3．1．H1hygro中,构建了表达载体,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建了livin表达载体,为后续研究奠定基础。     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

Y-盒结合蛋白1短发夹环RNA真核表达载体的构建

目的:构建Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体.方法:采用人U6SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的YB-1靶序列的反向重复序列,置于pGensil-1质粒载体中,构建成YB-1短发夹环RNA,产生重组质粒pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13.分别用Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定;并将经酶切鉴定正确后的重组质粒作测序分析.结果:YB-1的特异性shRNA片段被成功克隆进pGensil-1质粒中,Sal Ⅰ酶切鉴定可切出400 bp大小的片段,DNA测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致.结论:成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13,为进一步研究其基因功能打下了基础.     

RNA干扰Neuropilins-2基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建Neuropilins-2(NRP2)基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以NRP2为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构件重组体,根据GenBank数据库提供的NRP2基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.重组pGenSil-NRP2载体转染LOVO细胞48 h,收获细胞,采用Western blotting检测其NRP2蛋白表达.结果 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功.重组体pGenSil-NRP2转染LOVO细胞48 h后NRP2蛋白表达显著降低.结论 利用RNAi技术可成功构建抑制NRP2表达的小干扰RNA重组体.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。     

DPC4 RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的：构建DPC4基因tLNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法：针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端．直接连入酶切后的IKNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因1KNA干扰慢病毒载体。结果：经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4shRNA慢病毒栽体LVshSmad4,并成功制备了DPC4 shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SHI序列最为显著。结论：DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

干扰转酮醇酶的短发卡RNA表达载体的构建与筛选

目的筛选出干扰小鼠转酮醇酶(TK)的短发卡RNA(shRNA)表达载体。方法针对TK基因序列设计4条TK干扰序列:hMGFP-shRNA1、hMGFP-shRNA2、hMGFP-shRNA3、hMGFP-shRNA4,PstⅠ酶切鉴定其序列。然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,用逆转录-聚合酶链式反应和酶活性方法检测转染TKshRNA后Hepa1-6细胞内TK mRNA和蛋白表达变化。结果经酶切凝胶电泳证实shRNA载体构建正确,质粒筛选实验表明hMGFP-shRNA1质粒对TK基因的抑制作用最强。结论成功构建表达靶向TK的shRNA重组质粒载体。     

构建RNA干扰真核表达载体抑制肝癌细胞IGF1R表达的研究

目的 构建胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)RNA干扰真核表达载体,探讨人肝癌细胞株MHCC-97H在IGF1R基因抑制前后黏附和侵袭能力的变化及相关信号分子的变化。方法 以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体,以IGF1R为靶基因,按GeneBank IGF1R基因核苷酸序列和Tusch1设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中。转化大肠杆菌Stable3,扩增后提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。转染模型细胞（293T）,进行RT-PCR及Western blotting检测,筛选出沉默效果最好的质粒载体。用脂质体转染MHCC-97H肝癌细胞,G418筛选并建立IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞株。检测MHCC-97H细胞株黏附和侵袭能力及FAK蛋白的表达变化。结果 构建的IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA,经酶切和DNA测序证实与设计完全一致;RT-PCR及Western blotting检测发现IGF1R沉默效率达88%。MHCC-97H细胞IGF1R被沉默后黏附和侵袭能力下降,FAK蛋白表达下降。结论 IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA能够降低MHCC-97H细胞黏附和侵袭能力并抑制FAK蛋白的表达。     

TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响

目的 构建靶向肿瘤坏死因子转换酶(TACE)的小发夹结构 RNA(shRNA)的真核表达载体,观察干扰TA-CE 表达对 HeLa 细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计针对 TACE 基因的 4 个 shRNA 序列,构建真核表达载体 shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4.通过酶切和测序等方法进行鉴定.转染 HeLa 细胞后,用 Reahime PCR 的方法检测其对 HeLa 细胞 TACE 基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的 sTNF-α,间接反映干扰 TACE 的效果;用 MTT 法检测细胞增殖活性;用 DNA ladder 和流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建和筛选出了针对 TACE 基因的 3 个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了 HeLa 细胞 TACE 基因的表达.ELISA 检测结果与 Reahime PCR实验结果相符.同时发现干扰 TACE 基因后,HeLa 细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05).实验组转染 shRNA1～3 后 72 h 可见特征性的基因组 DNA ladder 条带.结论 所构建的TACE shR-NA 真核表达载体能显著抑制 TACE 的表达.干扰 TACE 基因的表达可有效抑制 HeLa 细胞的增殖并诱导其凋亡.     

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的：构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上定其沉默效率。 方法：针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。 结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10⁸ PU/L。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。 结论：成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞增殖及凋亡的影响

目的 构建Survivin的shRNA表达质粒并将其导入白血病细胞株HL-60细胞以探讨PNA干扰对HL-60细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成两对针对survivin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的裁体质粒pSINsi-Hu6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2.pSIN/shRNA1转染HL60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功.MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1入HL-60细胞48、72和96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组组比较,差异有显著性(P＜0.05).流式细胞仪分析pSIN/shRNA1组胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%.结论 成功地构建了survivin基因RNAi真核表达栽体,且pSIN/shRNA1可序列特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,为白血病的基因治疗奠定基础.