亚麻纤维素合酶超基因家族的生物信息学及表达分析

【目的】全基因组水平鉴定亚麻纤维素合酶超家族基因Ces A/Csls,并对基因的进化、基因结构及组织表达特性等进行分析,为亚麻纤维发育的机理研究奠定基础。【方法】利用Phytozome基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定亚麻纤维素合酶超基因家族成员,并进行蛋白理化特性分析;利用MEGA 5.0、GSDS、MEME等软件构建系统进化树,并进行基因结构、蛋白保守基序分析;根据RNA-Seq数据对Ces A/Csls进行表达分析。【结果】系统分析鉴定了45个亚麻Ces A/Csls超家族基因,该家族基因在scaffolds上是分散分布的,没有明显的成簇现象。Ces A/Csls蛋白主要分布于质膜上,氨基酸数目为409—1 167,分子量为47 401.1—130 578.3,等电点分布在5.43—9.08。Ces A/Csl蛋白均含有跨膜结构域,数目为2—8。根据系统进化分析将其分成Ces A与Csl两类,细分为Ces A、Csl A、Csl B、Csl C、Csl D、Csl E、Csl G共7组。基因结构分析显示,亚麻Ces A/Csls基因的长度在2.1—6.8 kb,外显子数量在2—14。保守基序分析表明,不同组间Motif组成有一定的差异,Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 12在Ces A、Csl B、Csl D、Csl E、Csl G组蛋白中均有分布,Motif 18、Motif 20在Csl A、Csl C组蛋白中均有分布,而Motif 13、Motif 14、Motif 15、Motif 19的分布则表现出一定的组间特异性。表达谱分析结果表明,Ces A/Csls家族成员在不同发育阶段表达模式不同,部分Ces A/Csls可被Na Cl、BR和Brz诱导上调或下调表达,预示Ces A/Csls功能的多样性以及在植物发育过程中扮演着不同角色。【结论】鉴定出45个亚麻Ces A/Csls家族基因成员,分属于两类,7组,分布于scaffolds上,基因结构和蛋白基序具有组间多样性和组内保守性。不同的基因在不同发育阶段具有一定的时空特异性。Ces A/Csls中部分基因响应激素BR、Brz及Na Cl胁迫。     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）和葡萄（Vitis vinifera）的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜（N.grossedentata）黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。     

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

目的查尔酮合酶(CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在植物次生代谢物的合成中起着重要的作用。本研究通过对栾树CHS 基因进行克隆与生物信息学分析,以及分析栾树 CHS 基因表达与类黄酮合成的关系,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、 CHS 基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。方法以栾树叶片为材料,采用RT...     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

拟南芥纤维素合酶的抗体制备与检测

将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-AtCe-sAs,在大肠杆菌JM109中经IPTG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。采用GST亲和层析法纯化GST-AtCESAs并制备了多克隆抗体。Western-blotting检测表明,抗体Anti-CESA4和Anti-CE-SA7存在明显的交叉反应,Anti-CESA1、Anti-CESA3、Anti-CESA6、Anti-CESA2、Anti-CESA5、Anti-CESA8均能在拟南芥原生质膜上检测到特异免疫条带,这为进一步深入研究拟南芥纤维素合成机制提供了有利条件。     

地黄纤维素合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据以前克隆的地黄Rgh BNG基因碱基序列,利用Primer Premier 5.0设计特异引物,采用hi TAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出578 bp DNA片段。经生物信息学分析发现,它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%~91%;它所含的453 bp的开放阅读框(ORF)编码蛋白质的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纤维素合酶基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性高达83%~99%,说明蛋白质可能具有纤维素合酶的结构域。用hi TAIL-PCR技术克隆怀地黄纤维素合酶基因,为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定了基础。     

纤维亚麻LuNAC10基因克隆及表达分析

NAC作为植物特有转录因子,调控植物细胞次生壁合成。研究从高纤亚麻“Diana”中克隆得到Lu NAC10(Lus10013967)基因。通过序列分析发现,基因Lu NAC10开放阅读框总长度为978 bp,共编码325个氨基酸,蛋白分子质量为35.53 ku,其中蛋白疏水系数-0.787,为亲水性蛋白,不稳定系数38.10,属不稳定蛋白,无跨膜结构,具有单个典型NAM结构域,通过PSORT分析推测Lu NAC10蛋白定位于细胞核中。通过同源比对和聚类分析发现,亚麻Lu NAC10与拟南芥SND3蛋白（AT1G28470）进化关系最近。q RT-PCR结果表明,Lu NAC10基因表达量高峰出现在亚麻茎下部1/3处,亚麻根部及茎中部次之,叶片中表达量最低;从苗期到工艺成熟期,该基因表达量总体呈先升后降趋势,并在亚麻快速生长期表达量达到最高。该基因与参与次生壁合成的纤维素合酶基因Lu Ces A4、Lu Ces A8A表达量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数分别为0.989和0.987。同时,Lu NAC10基因表达量与纤维素含量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数...     

水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定

纤维素合酶是参与纤维素β-1,4-葡聚糖链延伸的主要催化亚基,为进一步研究水稻中纤维素合酶的作用机理,采用DNA重组技术,将纤维素合酶基因CesA1、CesA2、CesA3克隆入表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒.在大肠杆菌JM109中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后在原核细胞中成功表达了3种纤维素合酶的...     

亚麻MAPK基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析

为研究MAPK基因与亚麻应答盐碱胁迫的关系,利用生物信息学方法从亚麻基因组中预测得到20个亚麻MAPK基因,命名为Lu MPK1~Lu MPK20,这20个MAPK基因都含有T[D/E]Y保守结构域,除Lu MPK5和Lu MPK20以外,其他基因都是两两一组。利用PCR技术克隆得到5个亚麻MAPK基因(Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16),这5个基因序列与预测序列完全一致。利用数字基因表达谱数据,分析亚麻盐碱胁迫下这5个基因的表达情况。结果表明,这5个基因的表达均受到盐碱胁迫影响。Lu MPK3、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16在中性盐胁迫下上调表达,Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14在碱性盐胁迫下上调表达,Lu MPK16在碱性盐胁迫下下调表达。研究为亚麻MAPK基因功能,尤其是耐盐碱功能研究奠定理论基础。     

岷江百合单萜合酶基因克隆与表达分析

以岷江百合花被片为材料,通过RT-PCR方法,克隆单萜合酶基因,命名为LreTPS.该基因包含1770 bp的开放阅读框,编码590个氨基酸,编码蛋白质分子质量为68.18 ku,等电点为5.77.LreTPS编码的蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W保守基序,氨基酸序列N端含有一段转运肽,与其他植物的单萜合酶基因蛋白同源性为40%-50%.系统进化树分析表明,LreTPS基因属于TPS-b亚家族.荧光定量表达结果表明,LreTPS在岷江百合花被片中表达量最高,其次在叶片中,在雄蕊与柱头中微量表达.     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

紫菜薹花青素合成酶基因BcANS的克隆、表达与序列分析

根据前期在芥蓝中克隆的BaANS基因序列设计PCR引物,从紫菜薹(Brassica campestris var.purpurea)子叶中克隆到基因组DNA和cDNA序列,基因定名为BcANS;序列已提交NCBI数据库,登录号为GQ120562;BcANS的基因组DNA全长为1 637 bp,具1个560 bp的内含子,编码区全长为1 077 bp,编码358个氨基酸.RT-PCR检测结果表明:BcA NS在光照条件下表达,在暗培养植株的子叶和胚轴中未见表达;缺磷植株的子叶和胚轴在暗培养和光照培养下BcANS基因均有表达,但光照条件下的表达量较大.序列比对结果表明:BcANS与同科的甘蓝、芥菜和拟南芥的同源性最高,而与禾本科植物的同源性最低,在进化树上相距最远.对紫菜薹花青素合成酶基因的克隆和表达分析,为进一步开展基因功能和花青素生物合成机制研究奠定了基础.     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

Structure and expression analysis of the sucrose synthase gene family in apple

Sucrose synthases (SUS) are a family of enzymes that play pivotal roles in carbon partitioning, sink strength and plant development. A total of 11 SUS genes have been identified in the genome of Malus domestica (MdSUSs), and phylogenetic analysis revealed that the MdSUS genes were divided into three groups, named as SUS I, SUS II and SUS III, respectively. The SUS I and SUS III groups included four homologs each, whereas the SUS II group contained three homologs. SUS genes in the same group showed similar structural characteristics, such as exon number, size and length distribution. After assessing four different tissues, MdSUS1s and MdSUS2.1 showed the highest expression in fruit, whereas MdSUS2.2/2.3 and MdSUS3s exhibit the highest expression in shoot tips. Most MdSUSs showed decreased expression during fruit development, similar to SUS enzyme activity, but both MdSUS2.1 and MdSUS1.4 displayed opposite expression profiles. These results suggest that different MdSUS genes might play distinct roles in the sink-source sugar cycle and sugar utilization in apple sink tissues.     

亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

研究通过克隆亚麻纤维素合成酶Lusi Ces A1基因,利用抑制差减杂交(SSH)技术,以DIANE Lusi Ces A1基因敲除RNA为Tester,常规RNA为Driver,构建亚麻纤维素合成酶c DNA文库,逆向斑点杂交验证阳性克隆,筛选差异表达克隆,鉴定出Lusi Ces A1上调表达增强基因122个,其中95个与已知功能基因同源,其余27个未知同源序列推断为亚麻纤维素合成途径新基因。Lusi Ces A1是亚麻纤维素合成途径关键酶基因,通过其上调表达作用机理分析,挖掘纤维合成过程上调表达基因,可改良亚麻品种。     

鹤望兰八氢番茄红素合成酶基因克隆及表达分析

[目的]揭示八氢番茄红素合成酶(PSY)基因在鹤望兰花色形成中的作用.[方法]依据植物PSY基因的氨基酸保守序列设计引物,从鹤望兰黄色花萼中克隆PSY片段,对该片段进行序列比对和系统进化分析,并应用RT-PCR技术分析PSY基因在不同器官和花朵发育过程中的表达特性.[结果]克隆获得248 bp的PSY段,编码82个氨基酸,经注册,在GenBank的登录号为JN887695.由该片段推导出的氨基酸序列与其他植物的PSY蛋白有很高的同源性,其中与大蒜的亲缘关系最近,达90%,初步证明为目标基因.此外,该基因在鹤望兰始花期和黄色萼片中表达量最高.[结论]PSY可能在转录水平上对鹤望兰黄色花的形成起调控作用.     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。