PK-15细胞生物学特性鉴定

对PK-15细胞进行细胞形态、生长曲线、微生物、外源病毒、胞核学及细胞致瘤性等特性进行了研究。结果表明,PK-15细胞呈不规则多边形、生长状态良好,无细菌、外援病毒及支原体污染,染色体共19对,细胞无致瘤性。     

PPV感染PK-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mRNA转录时相的影响

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PGK1 mRNA的相对表达量在感染后2 h显著增加,之后下降;TGF-β1 mRNA的相对表达量在72 h时显著增加;MURR1 mRNA的相对表达量在24 h时显著增加,48 h后下降。【结论】PPV感染可引起PK-15细胞抗病毒因子mRNA表达水平升高。     

PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

[目的]构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础.[方法]提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理.处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒.[结果]3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0× 106、2.0× 106和2.0× 106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%.cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp.cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg.[结论]构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制.     

猪细小病毒感染PK-15细胞后TLRs转录时相的变化

研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达水平变化情况,为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转录时相变化。结果显示,PPV感染PK-15细胞后,TLR1在PPV感染后3h表达上调,约为对照组细胞的3.1倍,其他时段均低于正常水平;TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平;TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表达上调,TLR10分别在在3h和36 h表达上调,其他时段均不同程度的降低;而TLR2和TLR9 mRNA表达水平在感染后24 h开始升高,并于48 h达到峰值,分别为对照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9在mRNA水平显著上调,PPV感染可能通过TLR2和TLR9受体介导感染。     

PCV-2感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响

【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的表达量在感染12 h时显著增加,其他时间表达量下降;IFN-γ、MHC-Ⅱ的表达量在感染12 h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染PCV-2后IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MX1的表达量下降;RNaseL的表达量在感染12 h时显著减少,其他时间表达量增加,48 h时表达量增加显著;IFNAR-1的表达量在感染72 h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出NOS的表达。【结论】随着PCV-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明PCV-2感染PK-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。     

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。     

连翘酯苷A对玉米赤霉烯酮诱导的PK-15细胞凋亡的影响

为探究连翘酯苷A(FA)对玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导的猪肾上皮细胞PK-15凋亡的影响及其可能的保护机制,体外培养PK-15细胞,经36.55μg·mL^-1 ZEA和不同质量浓度(31.25、62.50、125.00μg·mL^-1)FA处理24 h,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率;通过Hoechst 33342活细胞染色在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况;利用试剂盒检测细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性和活性氧(ROS)水平;利用实时荧光定量PCR测定细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA的表达水平.结果表明：质量浓度在125.00μg·mL^-1以下的FA可以提高PK-15细胞存活率;FA能显著提高经ZEA处理的PK-15细胞存活率,且能显著降低经ZEA处理的细胞上清液中的LDH活性,抑制ZEA引起的ROS的生成;ZEA能显著提升Bax、Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达量,Bcl-2 mRNA的表达量显著降低;不同质...     

PCV-2感染对PK-15细胞IL mRNA转录水平的影响

【目的】观察猪圆环病毒2型（PCV-2）感染对猪肾传代细胞（PK-15细胞）炎性细胞因子白细胞介素（IL） mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV2感染PK15细胞后,PCV-2 DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18 mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72 h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18 的mRNA转录水平在12 h显著增加,24 h后mRNA转录水平下降;IL-8的mRNA转录水平在48 h时最高,为对照组的2.5倍,但72 h时恢复至与对照组水平相当;随着感染时间的延长,IL-12p35、IL-12p40 的mRNA转录水平显著下降。【结论】PCV-2感染后可引起PK-15细胞中IL-6、IL-8、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子mRNA转录水平增加,而IL-12 mRNA转录水平下降,提示PCV-2感染后引起的PK-15细胞炎性反应与其分泌的炎性细胞因子的改变有关。     

异源益生菌株抗病原体作用差异性比较

为探索异源益生菌株抗病原体作用差异性,对猪源益生菌、鸡源益生菌和狐貉源益生菌进行抗TGEV病毒活性和抑制大肠杆菌O78及致病性金黄色葡萄球菌作用测定.结果表明,益生菌株抗病原体作用存在来源差异性和种属差异性,当益生菌株来源与病原体来源相同时,益生菌表现更强抗病原体活性.     

猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究

【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY11-7082(混合抑制剂)组。BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5μmol BX795、5μmol BAY11-7082、0.5μmol BX795+5μmol BAY 11-7082预先处理1 h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72 h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA 含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),TLR9的表达量在48、72 h显著升高(P0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),RIG-1的mRNA 含量在72 h显著升高(P0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比无显著性差异(P0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比明显下降(P0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。     

复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒的PK-15细胞中Bcl-2/BAX mRNA转录的影响

【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)的猪肾细胞（PK-15）中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV,用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究,试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组,在测定了病毒半数感染细胞量（TCID50）,复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后,制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Bcl-2和BAX mRNA转录情况。【结果】与空白组相比,模型组的PK-15细胞发生了明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,细胞变细长,细胞间成网状,细胞核着色较浅,出现核浓缩、固缩、碎裂等现象;与模型组比,复方苦芩组与黄芪多糖组细胞病变得到改善,而复方苦芩组效果更加明显,大部分细胞核结构清晰,染色质着色均一,少部分细胞核变大或碎裂;与空白组相比,模型组Bcl-2 mRNA转录量减少（P＜0.01）,复方苦芩组Bcl-2基因转录量增加,为模型组的1.403倍（P＜0.01）、黄芪多糖组的1.078倍（P＞0.05）;与空白组相比,模型组BAX mRNA转录量明显升高,而其他3组BAX基因转录差异不明显（P＞0.05）,模型组BAX基因转录量为空白组的1.440倍、复方苦芩组1.290倍、黄芪多糖组的1.490倍,差异极显著（P＜0.01）,复方苦芩组、黄芪多糖组BAX基因转录量分别为空白组的1.116倍、0.966倍,差异不显著（P＞0.05）;与空白组相比,模型组Bcl-2/BAX mRNA转录比值降低,差异极显著（P＜0.01）;与模型组相比,复方苦芩组、黄芪多糖组Bcl-2/BAX mRNA转录比值均增加,分别为模型组1.809倍和1.940倍,差异极显著（P＜0.01）,复方苦芩组Bcl-2/BAX mRNA转录比值分别为空白组的0.749倍（P＜0.01）、黄芪多糖组的0.933倍（P＞0.05）。【结论】复方苦芩可通过上调PK-15细胞Bcl-2 mRNA转录,下调BAX mRNA的转录,从而抑制TGEV引起的PK-15细胞凋亡。     

鸡胚成纤维细胞与鸡气管黏膜上皮细胞共培养体系的建立

【目的】建立鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells,CTECs)和鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEFs)共培养体系,为CTECs体外培养研究与应用奠定基础。【方法】利用细胞套皿培养方法,使CEFs与CTECs体外共培养在一个营养体系中,用含有不同促细胞生长因子(氢化可的松(HC)、转铁蛋白(TF)、人表皮生长因子(HEGF)或牛垂体提取物(BPE))和血清(胎牛血清、鸡血清)的培养液培养,观察各组CTECs的生长情况,绘制生长曲线,记录CTECs体外生长增殖的特点。【结果】与单独培养的CTECs相比,共培养体系中的CTECs体外贴壁、生长增殖能力均显著提高,72h能够铺满整个培养皿,并呈典型的上皮细胞"铺路石"状排列。共培养体系中的CTECs,在缺少3种重要哺乳动物气管黏膜上皮细胞培养所需的促细胞生长因子培养液中,仍能保持较好的生长能力,大大降低了CTECs的培养成本。【结论】成功建立了CTECs与CEFs的共培养体系,为CTECs的体外培养和应用提供了技术支持。