地高辛标记探针Southern印迹法鉴别霍乱弧菌的溶血型

选用地高辛标记的霍乱弧菌溶血素基因作为探，对霍乱弧菌两种生物型的几株溶血菌株和不溶血菌株进行脱氧核酸转膜杂交。结果表明霍乱弧菌两种生物型无论不否有溶血现象均存在着拷贝数不等的溶血素基因。其基因考贝数目与无溶血无一定关系。     

O139霍乱弧菌的分子流行病学特征

利用ｃｔｘＡ，Ｚｏｔ，Ａｃｅ，ＲＳ１，ｓｔ和ｉｇａ等基因探针检测５７８株霍乱弧菌，发现其中１株埃尔托型霍乱弧菌和６株Ｏ１３９霍乱弧菌不含ｃｔｘＡ，进一步分析证明这７个菌株中，除１株含ＲＳ１序列外，其他毒力基因检测均为阴性，这为菌苗候选株的筛选提供了依据。用１６ＳｒＲＮＡ基因探针检测不同地区分离的６２株Ｏ１３９菌株和Ｏ－１群埃尔托型菌株，将其分为９个１６ＳｒＲＮＡ基因型。结合ｃｔｘＡ探针检测结果，认为我国流行的Ｏ１３９霍乱弧菌有两种类型，与印度、孟加拉国分离的菌株不尽相同。本文首次报导，通过１６ＳｒＲＮＡ基因检测，可区分Ｏ－１群埃尔托型霍乱弧菌与Ｏ１３９霍乱弧菌，并建议将ｃｔｘＡ、１６ＳｒＲＮＡ两个基因作为确定Ｏ１３９霍乱弧菌分子流行病学特征的指标。     

反向膜杂交技术快速检测质粒介导喹诺酮耐药基因qnr方法的建立

目的 结合PCR与反向膜杂交技术,探讨建立快速筛查细菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr的方法.方法 将qnr各亚型的特异性探针加尾后固定于尼龙膜上,用标记生物素的各亚型引物分别扩增经提取的细菌DNA,与固定在膜上的探针杂交.结果 25株qnr阳性菌株中,有6株qnrA阳性菌株,9株qnrB阳性菌株,10株qnrS阳性菌株.所有阳性菌株均能通过反向膜杂交检测到相应的qnr基因的亚型,且可以在同一张膜上进行检测.结论 该方法能够快速、准确地检测出临床病原微生物中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr,这对于指导临床及时合理用药,采取措施防止耐药菌的传播均有重要意义.     

两种念珠菌DNA探针的研制及应用

目的：制备两种念珠菌DNA探针并应用于临床诊断。方法：对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的E03基因的125bp片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的E03基因中25bp特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与23株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果：Dig-125bpDNA探针显色敏感度为0.01pg，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。Bio-25bpDNA探针显色敏感度为20pg，与白色念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论：Bio-25bp DNA探针可用于念珠菌初步鉴定，而Dig-125bp DNA探针可用于白色念珠菌的鉴定。     

RIFO杂交和限制性片段长度多态性检测耐利福平和异烟肼的结核分枝杆菌

目的评价利福平寡核苷酸探针杂交技术（RIFO杂交）和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在结核分枝杆菌（MTB）耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）快速检测中的应用价值。方法选取121株北京地区MTB菌株，分别采用RIFO杂交技术和PCR—RFLP检测RIF耐药相关基因rpoB核心区和INH耐药相关基因katG315位点突变，并对所有菌株的rpoB基因核心区进行测序验证。结果RIFO杂交检测发现，91，5％（65／71）的RIF耐药株和92．9％（52／56）的耐多药菌株（至少对RIF和INH耐药）存在rpoB基因核心区突变，而RIF敏感株中未发现突变；RIFO杂交与测序结果完全一致，测序结果中有突变的位点在RIFO杂交中均有相应的野生型杂交信号缺失；PCR-RFLP结果显示，INH耐药株中katG315突变率为60.6％（40／66）。结论rpoB基因核心区可作为RIF耐药检测的分子标志及耐多药的筛选指标；RIFO杂交技术是检测MTB耐RIF的快速、准确的实验方法，具有推广及潜在的临床应用价值；PCR—RFLP可检测出大部分INH耐药株，可作为临床INH耐药性检测的辅助手段。     

应用DNA探针检测甲氧西林耐药葡萄球菌

目的建立一种快速检测葡萄球菌和甲氧西林耐药葡萄球菌的斑点杂交技术。方法设计金黄色葡萄球菌nuc基因、甲氧西林耐药mecA基因、葡萄球菌tuf基因的特异引物,用聚合酶链反应合成其特异DNA探针,并用生物素标记,分别与固定在硝酸纤维素膜上的标准菌株和临床分离株模板DNA杂交,观察其敏感性和特异性。结果3对引物分别扩增出270bp、310bp、370bp3种DNA探针,均具有高度特异性。50株金黄色葡萄球菌tuf、nuc基因均为阳性：mecA基因阳性者22株。30株表皮葡萄球菌tuf基因均为阳性,nuc基因均为阴性,mecA基因阳性者9株。而其他非葡萄球菌与3种DNA探针杂交结果均为阴性。该方法可检测出1 ng细菌DNA。结论斑点杂交技术检测耐甲氧西林葡萄球菌快速、有效,具有较高的应用价值。     

抗O／129的非O1群霍乱弧菌分子生物学特征研究

为了从遗传学基础上，探索抗Ｏ／１２９的非Ｏ１群霍乱弧菌的基因结构的特点，即对１９９２～１９９４年从肠道门诊急性腹泻患者粪便中分离到的２１株抗Ｏ／１２９的非Ｏ１群霍乱弧菌的分子生物学特性进行了研究，结果显示，染色体ＤＮＡ经核酸限制性内切酶ＰｓｔＩ消化后，用琼脂糖凝胶电泳分离ＤＮＡ，全部菌株表现为多样化特征的限制性酶谱，用Ｄｉｇ标记的基因探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，无一株菌具有Ｏ１群霍乱弧菌流     

霍乱弧菌16SrRNA基因分型研究

利用１６ＳｒＲＮＡ基因探针分析了某地不同时期分离的８８株霍乱弧菌经ＢｇｌⅠ消化的１６ＳｒＲＮＡ基因限制性酶谱,结果发现各菌株的杂交片断范围为２－１２ｋｂ,每个菌株有６－９条杂交带不等。８８株霍乱菌株可分为９个１６ＳｒＮＲＡ基因型（ＲＴ）,其中ＥＶＣ可分为６个ＲＴ,ＶＣＯ１３９分为３个ＲＴ,认为霍乱流行菌株基因型的变迁可能是引起新一次流行的原因。结合ｃｔｘＡＢ基因检测结果,我们认为ＶＣＯ１３９与ＥＶ     

超广谱TEMβ—内酰胺酶检测及分型

目的 建立有效和实用的方法,检测质粒介导的ＴＥＭ型超广谱β－内酰胺酶并对其分型。方法 采用聚合酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯ）首先用ＴＥＭβ－内酰胺酶基因的通用引物进行扩增,再用序列特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交,对多株标准产酶菌株进行分型。结果 产ＴＥＭβ－内酰胺酶的菌株扩增阳性,而产其他β－内酰胺酶的菌株扩增阴性,探针杂交的结果符合标准菌株的产酶型别。结论 ＰＣＲ－     

甲鱼及养殖水中5株带毒力基因O1群霍乱弧菌的分离与鉴定

目的监测杭州市江干区水产品中O1群和O139群霍乱弧菌并对分离菌株进行病原学鉴定及分子分型。方法按《霍乱防治手册》第5版对51份样品进行霍乱弧菌分离与鉴定。运用改良Kirby-Bauer纸片法和PCR检测5株霍乱弧菌对14种临床常用抗生素的敏感性及是否携带ctxA和tcpA毒力基因,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果从51份样品中检出O1群霍乱弧菌5株,其中小川型4株,稻叶型1株。5株霍乱弧菌的ctxA和tcpA毒力基因结果均为阳性。5株菌株对11种抗生素敏感,对红霉素和利福平中介,稻叶型菌株对氨苄西林敏感,小川型菌株对其耐药。PFGE分为两型,两型间仅有一条带的差异。结论本次分离的5株O1群霍乱弧菌均携带ctxA和tcpA毒力基因,故有必要加强对水产品尤其是甲鱼的监测及管理。     

基因传感器研究新进展

基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上 ,然后与样品进行杂交 ,通过检测杂交信号强弱而判断样品中靶分子的数量。将基因芯片技术与传感器技术结合研制基因传感器 ,为近年来国际上基因检测技术的研究热点之一。本文评述了国内外近两年对光学、电化学和压电基因传感器及其应用的研究 ,并提出了基因传感器今后的研究方向和发展趋势     

结核杆菌耐药性调查与基因突变分析

目的了解结核分支杆菌耐药性与基因突变情况,分析耐药表型与基因突变的相关性。方法从临床标本中分离培养、鉴定结核分支杆菌;应用药敏试验、单链探针反向杂交试验技术(LiPA)和基因测序分析结核分支杆菌耐药性与基因突变情况。结果50株结核分支杆菌中,12株耐异烟肼(INH),7株耐利福平(RFP),15株耐链霉素(SM),2株耐乙胺丁醇(EMB)。LiPA检测耐RFP菌株,4株rpoB基因531位TCG→TTG突变;耐INH菌株中5株KatG基因315位AGC→ACC突变;耐SM菌株中6株、SM敏感株1株rpsl基因43位AAG→AGG突变,1株耐SM菌株rpsl基因88位AAG→AGG突变;rrs基因未检测到突变;1株耐EMB菌株与1株EMB敏感株的embB基因306位发生ATG→GTG突变。结论本市结核分支杆菌的耐药性增加的趋势显著,加强监测与综合干预非常必要。     

超广谱TEM β-内酰胺酶检测及分型

目的　建立有效和实用的方法,检测质粒介导的ＴＥＭ 型超广谱β内酰胺酶并对其分型。方法　采用聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲＳＳＯ） 技术,首先用ＴＥＭ β内酰胺酶基因的通用引物进行扩增,再用序列特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交,对多株标准产酶菌株进行分型。结果　产ＴＥＭβ内酰胺酶的菌株扩增阳性,而产其他β内酰胺酶的菌株扩增阴性,探针杂交的结果符合标准菌株的产酶型别。结论　ＰＣＲＳＳＯ 是一种有效的检测ＴＥＭ 超广谱β内酰胺酶及分型的方法。为临床检验、流行病学调查和研究提供了依据。     

抗O／129的非O1群霍乱弧菌分子生物学特征研究

为了从遗传学基础上，探索抗Ｏ／１２９的非Ｏ１群霍乱弧菌的基因结构的特点，即对１９９２～１９９４年从肠道门诊急性腹泻患者粪便中分离到的２１株抗Ｏ／１２９的非Ｏ１群霍乱弧菌的分子生物学特性进行了研究。结果显示：染色体ＤＮＡ经核酸限制性内切酶ＰｓｔＩ消化后，用琼脂糖凝胶电泳分离ＤＮＡ，全部菌株表现为多样化特征的限制性酶谱；用Ｄｉｇ标记的基因探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，无一株菌具有Ｏ１群霍乱弧菌流行株所具有的ＣＴ毒素基因；质粒图谱分析，仅有６株菌各含有一条质粒带，而且这６株菌同时对３～８种临床常用抗生素耐药，表明该菌株对Ｏ／１２９的抗性是非质粒性的。结果表明，抗Ｏ／１２９的非Ｏ１群霍乱弧菌与Ｏ１群霍乱弧菌非流行株具相似的遗传学特性和毒力特征，因而，它不是引起霍乱暴发的病原体。     

我国某地首株O139霍乱弧菌某些特征的研究

我国某地１９９６年６月从一名腹泻病人粪便中分离出首例Ｏ１３９霍乱弧菌，并将该菌与国内外菌株形态，生化和遗传学特性进行了比较研究，结果表明此菌株与国内外Ｏ１３９流行菌株具有相似的表型特性（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ），形态，生化特性与Ｏ１群相似，但对弧菌抑制剂（Ｏ／１２９）不敏感，不被Ｏ１多价血清凝集；用已知的几种霍乱弧菌毒素基因探针与被测Ｏ１３９菌株ＤＮＡ杂交，结果显示都具有ｃｔｘ，ｚｏｔ，ａｃｅ基因；ＰＣＲ检测ｃｔｘＡ基因与Ｏ１群霍乱流行株具有相同的扩增产物；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析外膜蛋白所有Ｏ１３９菌株图谱相似；用１６ＳｒＲＮＡ基因探针与ＢｇｌⅠ酶切的染色体ＤＮＡ杂交，结果表明此菌株与中国及国外菌株分属于不同的核糖体基因型（Ｒｉｂｏｔｙｐｅ，ＲＴ），而且与当年的Ｏ１群流行菌株具有相似的ＲＴ型，推测该菌株可能是Ｏ１群的突变株，对新毒株Ｏ１３９的出现应引起我们高度重视。     

多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的比较肺炎链球菌多重耐药株与敏感株标准参考菌之间的差异基因。方法使用抑制性消减杂交技术构建多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库,经斑点杂交筛选阳性克隆后对部分DNA片段进行测序和同源分析。结果成功的构建了肺炎链球菌多重耐药株差异DNA消减文库,经斑点杂交的初步筛选,有17个仅能与多重耐药株DNA探针杂交,而不能与敏感株DNA探针杂交。对这17个克隆片段测序及基因库检索分析,发现2个未知新序列。结论从全基因角度研究肺炎链球菌多耐药菌株与标准菌株基因组DNA分子遗传差异,为发现、克隆肺炎链球菌多重耐药相关基因提供依据。     

贵州省2000年甲型副伤寒沙门菌分离株16SrRNA基因型分析

近年来贵州省出现甲型副伤寒的流行。为探讨贵州省不同地区甲型副伤寒流行菌株的分子流行病学特征以及菌株间的相关关系 ,对贵州省 6个地 (市 ) 2 0 0 0年部分甲型副伤寒沙门菌分离株进行染色体DNA基因限制性酶切 16srRNA探针杂交图谱分析。PstⅠ酶切后进行的杂交显示 6 4株均为一个基因型 ,然后进一步采用BglⅠ、SalⅠ两个内切酶对其中部分菌株进行酶切杂交分析 ,核糖体杂交谱上仍没有差异 ,分析认为同一个克隆群的菌株广泛传播是造成贵州省甲型副伤寒流行的主要原因.     

PCR-反向线点杂交技术鉴定慢生长分枝杆菌的方法学研究

目的建立和评价以16S-23S rDNA间隔序列（ITS）为靶基因的PCR-反向线点杂交技术（RLB）快速鉴定慢生长分枝杆菌（SGM）的方法。方法PCR—RLB检测70株分枝杆菌参考菌株、4株诺卡菌参考菌株、5株红球菌参考菌株、1株棒状杆菌参考菌株，来源于中国生物制品和药品鉴定所和悉尼大学感染性疾病和微生物中心；358株分枝杆菌临床分离株来源于深圳、广州和澳大利亚。结果所有分枝杆菌参考菌株均可扩增出200～250bp DNA片段，分枝杆菌引物可扩增4种诺卡菌和5种红球菌，但不与分枝杆菌属探针和种探针杂交。21个探针可鉴定分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、溃疡／海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌a／b和堪萨斯分枝杆菌c亚种及其他16种SGM。结论该方法能快速、简便和准确地鉴定SGM。     

DPYD基因芯片的制备及条件的优化

[目的] 制备DPYD基因分型芯片，以该芯片为手段预测肿瘤病人对5-Fu的毒副作用。[方法] 设计并合成探针、引物，制备基因芯片，提取人外周血中DNA，经PCR仪扩增后，与芯片上的探针杂交，并用扫描仪分析结果，部分结果经直接测序证明。[结果] 成功制备了基因分型芯片，优化了制备条件，另外，构建了标准模板，并建立了分型标准。[结论] 该基因芯片的灵敏性及准确性均可.     

靶向mecA基因纳米胶体金探针快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立

目的 用以纳米胶体金颗粒为载体的DNA探针杂交技术,建立快速、简便和特异的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法.方法 以直径60 nm的胶体金纳米颗粒与巯基修饰的2条mecA基因特异性寡核苷酸探针共价结合,制备成纳米胶体金探针.直接提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA,经超声破碎后与纳米胶体金探针进行液相杂交.杂交产物经高速离心后再用反向色谱反应盘检测有无胶体金颗粒沉淀产生.用该法和PCR扩增试验同时检测临床分离株的mecA基因,以PCR法为金标准,评价纳米胶体金探针液相杂交法的准确性.结果 在95株临床试验菌株中PCR法共检出71株MRSA,24株MSSA.在71株MRSA中,纳米胶体金探针杂交试验有69株为阳性,敏感度为97.2%,最低检测限为4.72 fmol/L.而在24株甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)中,纳米胶体金探针杂交试验无一株阳性,特异度为100%.95株临床试验菌株中纳米胶体金探针杂交试验正确检出93株,准确度97.9%.结论 纳米胶体金探针杂交试验与PCR检测MRSA具有很好的一致性.应用胶体金探针杂交技术检测MRSA具有快速、简便、准确的特点,有望成为MRSA的快速诊断的新方法.