缺氧和血清剥夺诱导的PC12细胞DNA损伤与修复

探讨 PC12细胞在缺氧 ( 3 7℃ ,5 % O2 ,95 % N2 )、血清剥夺条件下 DNA损伤与修复、凋亡、坏死或生存的变化规律。应用单细胞凝胶电泳技术、流式细胞学技术检测在不同时间点 ,缺氧、无血清培养等诱导下对 PC12细胞单链 DNA损伤与修复、凋亡的影响。结果发现在 PC12细胞 DNA损伤值均在 0 .5 h时达第一个峰值 ,随后下降。 3 h后DNA损伤数值再次逐渐增加并达到最高值。细胞凋亡峰值略滞后于 DNA损伤峰值 ,并于 DNA损伤程度基本相平行。提示 PC12细胞在缺氧和血清剥夺条件下存在 DNA损伤与修复的动态变化过程 ,DNA损伤后可能直接诱导细胞凋亡 ,DNA损伤程度在早期与细胞凋亡程度相一致     

缺氧和血清剥夺诱导的PC12细胞NDA损伤与修复

探讨PC12细胞在缺氧（37℃,5％,O2,95％,N2）,血清剥夺条件下NDA损伤与修复,凋亡,坏死或生存的变化规律,应用单细胞凝胶电泳技术,流式细胞学技术检测在不同时间点,缺氧,无血清培养等诱导下对PC12细胞单链DNA损伤与修复,凋亡的影响,结果发现在PC12细胞DNA同伤值均在0.5h时达第一个峰值,随后下降,3h后DNA损伤数值再次逐渐增加并达到最高值,细胞凋亡峰值略滞后于DNA损伤峰值,并于DNA损伤程度基本相平行。提示PC12细胞在缺缺氧和血清剥夺条件下存在NDA务与修复的动态变化过程,DNA损伤可能直接诱导细胞凋亡,DNA缶伤程度在早期与细胞凋亡程度相一致。     

PC12细胞缺氧培养后细胞凋亡及其机制的研究

目的　探讨PC12细胞缺氧后细胞凋亡及其发生机制。方法　采用末端标记法 ,结合流式细胞术观察PC12细胞缺氧培养不同时间点细胞凋亡现象 ,以及DNA损伤相关基因表达的改变。结果　在缺氧 0 .5h开始出现凋亡细胞 ,p5 3、p2 1wafl/cipl蛋白表达也开始增高。至缺氧 1h凋亡细胞达高峰 ,p5 3、p2 1蛋白表达亦最高 (P <0 .0 1) ,缺氧 6～ 12h ,则以坏死为主 ,以上基因的表达均减弱。结论　缺氧后PC12细胞凋亡部分是由于DNA损伤严重、损伤不能及时得到修复所致。     

生物发光法测定PC12细胞微量ATP含量

目的　研究生物发光法测定PC12细胞内腺苷三磷酸 (ATP)含量的可行性及短暂缺氧血清剥夺再灌注后ATP含量的动态变化。方法　将PC12细胞随机分为正常对照组、缺氧组 ,测定短暂缺氧血清剥夺再灌注后不同时间点的ATP含量和细胞活性 ,对缺氧组ATP含量与细胞活性进行相关性分析。结果　与正常对照组相比 ,缺氧血清剥夺 15min再灌注1h后的ATP含量、细胞活性显著降低 ,差异具有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;缺氧血清剥夺 15min再灌注 6h后基本恢复至正常水平。缺氧组ATP含量与细胞活性呈显著正相关 (r=0 .90 4 ,P <0 .0 5 )。结论　生物发光法测定PC12细胞内ATP含量有较高的准确性。短暂缺氧血清剥夺再灌注后 ,存在低能量状态 ,且可完全恢复。     

自由基在心肌细胞缺氧性DNA损伤和凋亡中的作用

目的　研究自由基在心肌细胞缺氧性DNA损伤和凋亡中的作用。方法　将培养的大鼠心肌细胞随机分成 5组 ,即对照组、缺氧 2 4h组、SOD组、CAT组和SOD +CAT组。然后除对照组外 ,分别加入SOD、CAT或SOD +CAT的各用药组和缺氧2 4h组均缺氧培养 2 4h(其中SOD和CAT的浓度均为 4 0 0 μg/ml) ,终止培养后分别用单细胞微量凝胶电泳检测心肌细胞DNA的损伤和TUNEL标记检测细胞凋亡。结果　缺氧 2 4h后 ,各组心肌细胞核DNA明显受损 ,细胞发生凋亡。与单纯缺氧 2 4h组相比 ,SOD组、CAT组和SOD +CAT组的DNA损伤程度明显减轻 ,受损的细胞数明显减少 (P <0 .0 5 ) ,其中SOD +CAT组更显著(P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡的数量也明显减少 (P <0 .0 5 )。结论　自由基参与了心肌细胞缺氧过程中细胞核DNA的断裂损伤和细胞凋亡 ,使用自由基清除剂能减轻其缺氧损伤 ,对心肌细胞有保护作用     

血清剥夺致PC12细胞死亡及对细胞周期的影响

目的 观察血清剥夺致PC12细胞死亡及对细胞周期的影响。方法 流式细胞术检测在含5％和2％胎牛血清的培养基中，PC12细胞死亡和细胞周期的改变。结果 随着血清浓度的下降。PC12细胞死亡或凋亡增加，同时，S期的细胞所占百分比降低，G2期细胞所占的比例增加，在含2％胎牛血清的培养基中培养的细胞更加明显。结论 ①PC12细胞经血清剥夺培养后产生的损伤可能引发了细胞周期阻滞，当损伤未得以及时修复时，导致细胞凋亡。②在细胞周期和细胞死亡之间可能存在密切的联系。     

基于凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤的模型研究

目的：探索凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳反应时间点,为进一步研究凝血酶在缺血性脑损伤中的意义提供实验方法。方法建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。按照常规细胞培养方法,采用三气培养箱（1％ O2,5％ CO2,94％ N2）和无糖DM EM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入不同浓度的凝血酶（0、50、100、150和200 U／mL ）,再将每组都作用于1、6、12、24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）分析细胞的存活率、TUNEL法检测细胞的凋亡程度。结果随着缺氧时间的延长和凝血酶浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,TUNEL细胞阳性率和凋亡率逐渐升高。低浓度凝血酶（50 U／mL）在缺氧1 h后,与对照组（0 U／mL）相比细胞存活率有所升高,提示低凝血酶可能有保护作用。尤以缺氧12 h后开始细胞损伤更为明显,150 U／m L凝血酶组作用12 h后与对照组相比细胞存活率显著下降（ P＜0．01）,凋亡率显著增加（ P＜0．05）;且200 U／mL凝血酶作用12 h和150、200 U／mL 凝血酶组作用24 h后细胞存活率与对照组比较差异均有统计学意义（ P＜0．05）。结论150 U／mL凝血酶在缺氧作用12 h后为研究凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳模型条件。     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期变化与凋亡的关系

目的探讨β-淀粉样肽25-35(βamyloid peptide-25-35,Aβ25-35)诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化与凋亡的关系。方法用常规的去血清培养使细胞同步于G0期,采用终浓度为0~45μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞24h,用MTT比色法分析细胞存活率;Hoechst33258荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变;DNA电泳观察细胞凋亡时特异性梯状条带(DNA-Ladder);流式细胞仪检测分析细胞周期的改变与凋亡的时间关系。结果随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);用25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞12、24h,荧光染色结果显示24h出现典型的凋亡,表现为核固缩、核碎裂;DNA电泳结果显示凋亡特异性梯状条带;流式细胞仪分析表明去血清培养24h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8、16、24h与对照组比较,S期细胞比例增加(P<0.01),16h后细胞凋亡率增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰)。结论Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期并随之出现凋亡,提示Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡可能与细胞周期紊乱有关。     

不同浓度的氯化钴对 PC12分化细胞增殖与凋亡的影响

目的：观察不同浓度的氯化钴（CoCl2）对肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）分化细胞增殖与凋亡的影响,探讨合理的体外化学模拟缺氧模式。方法应用不同浓度CoCl2作用于PC12分化细胞不同时间,建立化学性缺氧诱导细胞凋亡的实验模型;将PC12细胞分为空白对照组、不同浓度不同时间的CoCl2处理组;应用细胞计数、MTT、Hoechst33342/PI双染色法检测不同浓度CoCl2对PC12分化细胞的增殖与凋亡的影响。结果①CoCl2（≤200μmol/L）在6h内使PC12细胞存活率轻度增加,12h后开始出现细胞存活率降低,并呈现比较明显的剂量和时间依赖关系;CoCl2（≥300μmol/L）诱导PC12分化细胞6h即开始出现存活率降低（P＜0．01）;②150μmol/L CoCl2诱导PC12分化细胞24h后细胞数量明显减少（P＜0．01）;③通过荧光显微镜可见150μmol/L CoCl2诱导PC12分化细胞24h内受损细胞多为早期凋亡,48h后开始出现晚期凋亡和坏死细胞增多。结论 CoCl2对PC12分化细胞增殖与凋亡的影响呈时间和浓度依赖性,进行化学模拟缺氧要考虑CoCl2的作用浓度和作用时间。     

银杏叶提取物对百草枯致PC12细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨百草枯(PQ)对PC12细胞的损伤作用,观测银杏叶提取物(EGB761)对该损伤的保护作用并探讨其作用机制.方法MTT比色试验检测细胞活性;乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞损伤程度;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡;caspase-3免疫细胞化学染色观察细胞凋亡.结果40mg/L EGB761对300μmol/LPQ作用于PC12细胞24h,具有一定的保护作用;EGB761可明显抑制PQ诱导的PC12细胞LDH的释放(0.25±0.01)(与PQ组比较,P<0.05);EGB761可降低PC12细胞的凋亡百分率,PQ组凋亡百分率为66.7%,使用EGB761保护后凋亡百分率降为17.1%;并可减少PQ诱导的PC12细胞caspase-3过度表达.结论EGB761可减轻PQ诱导的PC12细胞损伤和凋亡,该作用可能与抑制caspase-3蛋白酶的激活有关.     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期紊乱及对P53和Cyclin D1基因表达的影响

目的:探讨Aβ25-35诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化及对P53和Cyclin D1基因表达的影响。方法:PC12细胞同步于G0期,采用终浓度为0-45μmol/L或浓度为25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞,用MTT比色法分析细胞存活率;流式细胞仪检测分析细胞周期的改变;RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测P53和Cyclin D1基因的变化。结果:随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);流式细胞仪分析表明去血清培养24 h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8,16,24 h与对照组比较,S期百分率明显增加(P<0.01),16 h后细胞凋亡率明显增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰);P53 mR-NA表达和P53蛋白表达降低、Cyclin D1 mRNA表达和Cyclin D1蛋白表达增高。结论:Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期,并阻滞于S期,同时出现凋亡,可能与下调P53的表达,上调Cyclin D1的表达有关。     

PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征

目的在体外模拟能量代谢障碍研究PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征.方法电镜观测形态改变,MTT检测功能异常,RT-PCR测定Bcl-2在RNA水平上的表达.结果电镜观察到细胞有凋亡现象;MTT显示细胞活力降低;RT-PCR结果表明Bcl-2在6～16 h表达上调.结论缺糖损伤的PC12细胞既有形态的变化也有功能上的变化,并同时伴随着凋亡和坏死两种死亡现象.     

短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究

目的研究短暂缺氧、血清剥夺复氧复注血清(再灌流)后神经细胞顿抑现象及其可能机制.方法将PC12细胞随机分为正常对照组和缺氧组,每组根据不同的再灌流时间又分为3个亚组(缺氧组分别为缺氧15min再灌流1h组、3h组、6h组,正常对照组各亚组的时间点与缺氧组相对应).测定短暂缺氧血清剥夺再灌流后不同时间点的三磷酸腺苷含量、线粒体膜电位和细胞活性.结果与正常对照组相比,缺氧血清剥夺15min再灌流1h后的三磷酸腺苷含量(1.05±0.34)、线粒体膜电位(41.39±1.242)和细胞活性(0.809±0.087)显著降低(P ＜0.05),且于再灌流6h后基本恢复至正常水平.结论短暂缺氧血清剥夺再灌流后,存在低能量状态,且可完全恢复,表明可能存在神经细胞顿抑现象,其原因可能与再灌流后线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶等活性下降及线粒体的膜电位变化等有关.     

环孢霉素A对缺氧血清剥夺再灌流后PC12细胞的保护作用

目的 :研究环孢霉素A对短暂缺氧血清剥夺再灌流后PC1 2细胞的保护作用和可能的作用机制。方法 :将PC1 2细胞随机分为对照组、缺氧组和干预组 ,缺氧组于缺氧血清剥夺 1 5min后复氧复注血清 1h ,干预组自缺氧前 4h即给予环孢霉素A ,并同样于缺氧血清剥夺 1 5min后复氧复注血清 1h ,测定各组ATP含量 (生化发光法 )、线粒体膜电位 (Rhodamine1 2 3标记 ,流式细胞仪测定 )、细胞活性 (MTT法 )。结果 :与对照组相比 ,缺氧组ATP含量、线粒体膜电位、细胞活性显著降低 ,差异具有统计学意义 (P <0 .0 1 ) ;干预组与缺氧组的ATP含量、线粒体膜电位、细胞活性的差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )。干预组与对照组间差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :环孢霉素A是线粒体膜渗透性转换孔抑制剂 ,在短暂缺氧血清剥夺再灌流后对维持PC1 2细胞线粒体的完整和功能起着非常重要的作用 ,具有明显的神经保护作用     

丹酚酸B对缺糖诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的研究丹酚酸B（Salvianolic acid B,Sal B）对缺糖诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法以无糖培养的PC12细胞建立模型,采用甲基噻唑基四唑检测细胞存活率;采用流式细胞仪检测碘化丙啶单染的PC12细胞凋亡;Western blotting法检测细胞内Caspase-3蛋白的表达。结果 Sal B可明显抑制缺糖对PC12细胞诱导的损伤,在0.1-100μmol/L浓度范围内呈一定的量效关系;流式细胞术显示Sal B显著降低缺糖诱导的PC12细胞凋亡;Western blotting结果显示Sal B显著降低缺糖诱导的活性Caspase-3蛋白的表达。结论在0.1-100μmol/L浓度范围内,Sal B对缺糖损伤的PC12细胞具有保护作用,其保护机制可能与抑制Caspase-3表达有关。     

凝血酶对大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤的动态研究

目的　研究脑出血血液凝固释放的凝血酶对神经细胞DNA的损伤 ,探讨脑出血神经细胞损伤的机制。方法　采用立体定位技术 ,将 15U凝血酶注入大鼠右侧尾状核 ,并用凝血酶的特异抑制剂水蛭素进行干预 ,于不同时相点测定TUNEL阳性细胞及caspase 3免疫反应性 (Immunoreactivity ,IR)细胞的表达。结果　凝血酶组TUNEL阳性细胞于造模后 12h出现 ,3d达到高峰 ,1周仍有较多表达 (P <0 0 1) ;caspase 3IR 6h开始表达 ,1d达高峰 ,1周仍有少量表达。水蛭素干预组TUNEL阳性细胞较凝血酶组明显减少 (12h ,1d ,3d ,1周 ,P <0 0 1) ;caspase 3IR较凝血酶组明显降低 (6h ,12h ,1d ,3d ,P <0 0 1;1周 ,P <0 0 5 )。结论　 15U的凝血酶可导致大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤 ,损伤持续时间 1周以上 ;凝血酶释放很可能是脑出血神经细胞凋亡的机制之一。