基于RhaD醛缩酶的“一锅四酶法”合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖

利用L-1-磷酸鼠李树胶糖醛缩酶（RhaD）以较低成本同时合成稀有糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。为避免直接使用价格昂贵且不稳定的底物磷酸二羟基丙酮（DHAP）,以便宜的底物DL-3-磷酸甘油作为前体,采用基于RhaD和磷酸酶（AP或YqaB）的\     

基于Staphylococcus carnosus来源的D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究

将Staphylococcus carnosus来源的Fru AS.car醛缩酶基因fda和大肠杆菌来源的Yqa B磷酸酶基因yqa B分别插入到表达质粒CDFDuet-1得到重组质粒CDF-fda-yqa B,并转化该重组质粒到大肠杆菌BL21Star(DE3)。以同时过量表达Fru AS.car醛缩酶和Yqa B磷酸酶的大肠杆菌BL21Star(DE3)/CDFDuet-1-fda-yqa B作为发酵菌株,以葡萄糖为碳源通过糖酵解途径在胞内生成供体磷酸二羟基丙酮,分别在培养基中添加丙醛、丁醛为受体,进行相应稀有酮糖的合成,从而成功地将羟醛缩合反应在大肠杆菌中实现,酮糖产物用HPLC检测并进行纯化和1H NMR鉴定。最后,以13C同位素全标记的葡萄糖为碳源,添加丙醛为受体进行了同位素标记实验,证实了产物从DHAP而来的3个碳原子最终来自葡萄糖。     

HPLC检测发酵液中二羟基丙酮和甘油的含量

应用高效液相色谱法检测发酵过程中发酵产物二羟基丙酮和底物甘油浓度。在流动相乙腈、纯净水的比例为85∶15(v∶v),流速为1mL/min,色谱柱为Hedera-NH2的条件下,用紫外检测器在271nm处检测DHA,用示差折光检测器检测甘油。高效液相色谱法检测DHA的线性范围为2.0-12.0mg/mL,相关系数(r)为0.9996,检测甘油的线性范围为0.1-1.0mg/mL,相关系数(r)为0.9998。该方法应用于二羟基丙酮发酵过程中底物和产物的检测,该方法不受培养基中不同碳源(葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、甘油),不同氮源(蛋白胨、酵母膏、酵母粉、营养肉汤)以及菌体未完全利用的培养基成分、菌体生长过程中产生的其它代谢产物的影响,该方法具有较好的通用性。     

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase,DPE）可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶（L-rhamnulose kinase,RhaB）具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,PPK）,可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta（DE3）中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35 ℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下：pH 8.5,温度35 ℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比（质量比）1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。     

凝结芽孢杆菌中耐热木酮糖激酶基因的克隆表达及生信分析

该研究以凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）IPE22为研究对象,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得木酮糖激酶基因Bc-XK,将其与载体pET-30a连接后,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中进行诱导表达。然后采用镍柱亲和层析纯化重组酶Bc-XK,对基因Bc-XK及其编码的蛋白质进行生信分析。结果表明,纯化后重组酶Bc-XK的酶比活力为（20.56±3.31） U/mg,热稳定性好,在60 ℃保持活力180 min以上,具有很好的工业应用潜力。Bc-XK基因含有一个1 536 bp的开放阅读框,共编码511个氨基酸,其编码的蛋白质为亲水蛋白,等电点（PI）为5.46,分子质量为56.15 kDa,二级结构中α-螺旋、无规卷曲和延伸链含量丰富,3个催化位点分别为天冬氨酸-8、苏氨酸-11、天冬氨酸-239,高度保守。     

乳酮糖及其在食品上的应用

乳酮糖作为一种理想的双歧杆菌增殖因子，是半乳糖和果糖组成的二糖。本文主要阐述了乳酮糖的理化性质，生理特性及其在食品工业上的应用。     

降茄二酮的合成及在烟草加香中的应用

降茄二酮是烟草中重要的香味成分，其对卷烟香味有重要贡献［１］。报道了以异戊醛为起始原料经烯胺化反应、与丁烯酮缩合、水解及与乙酰甲叉基三苯基膦缩合制备降茄二酮的合成工艺，对合成工艺进行了改进，对产品结构进行了ＩＲ及１Ｈ－ＮＭＲ确证，并对产品在烟草中的作用进行了研究。结果表明降茄二酮在烟气中的作用是增加烟香，使烟气醇厚，提高香气品质，是烟草加香有发展前途的重要香味物质。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD 为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4 和Na 对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.     

甘油半乳糖苷的分离纯化及鉴定

以半乳糖和甘油为原料,β-半乳糖苷酶为催化剂,制备甘油半乳糖苷。采用活性炭吸附法对其分离纯化,采用L9（34）正交试验对分离纯化的工艺条件进行优化筛选,进一步用G-15色谱柱纯化,以获得高纯度的甘油半乳糖苷。结果表明：活性炭吸附法分离纯化甘油半乳糖苷的最佳工艺条件为反应液稀释倍数20、活性炭用量2 g/mL、洗脱剂乙醇体积分数30%,甘油半乳糖苷的回收率和纯度分别为62.53%和48.84%,分别比单因素试验结果高4.52%和4.76%;经G-15柱色谱进一步纯化,甘油半乳糖苷的纯度达到97.80%;经质谱鉴定合成产物为甘油单半乳糖苷。     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

单辛酸甘油酯的酶法合成

以Novo435固定化脂肪酶为催化剂,在无溶剂条件下催化甘油和辛酸合成单辛酸甘油酯。通过单因素试验确定加酶量、反应温度、反应时间三个因素的取值范围,并用响应面实验设计和分析方法对合成反应条件进行了优化。结果表明,在甘油辛酸摩尔比1:1、反应温度66.8℃、脂肪酶与反应底物质量比0.88%、无水的条件下反应11.5h,辛酸转化率达93.53%,单辛酸甘油酯含量为47.69%。     

杂醇油提纯分离技术及应用

杂醇油是酒精发酵过程的副产物,也是重要的精细化工原料。从杂醇油中分离提取的异戊醇是一种化工紧俏产品,其主要用于香料、食品、食用香精、涂料、油漆、医药、选矿等行业。阐述了杂醇油的性质、产生原因和提取、提纯分离技术以及应用。     

钝齿棒杆菌ArgR蛋白的表达、纯化及其多聚体的形成

通过PCR技术从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542基因组中扩增得到长度为516bp的argR基因,将其连接到原核表达载体pET22b(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET22b-argR,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在33℃诱导8h实现高效可溶性表达,获得了一个分子质量为20kD的融合蛋白ArgR。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:160000。Western blot分析结果表明,L-精氨酸介导重组蛋白形成的多聚体,可与自制的鼠抗ArgR多克隆抗体进行特异性反应,与预期结果一致,表明ArgR通过与精氨酸共孵育形成了多聚体,该结果有助于采用凝胶阻滞方法对ArgR蛋白与钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中各操作子的结合情况进行进一步研究。     

羧甲基羟乙基淀粉的制备及在涂布纸中的应用初探

本文合成了聚阴离子羧甲基羟乙基淀粉(HECMS),考察了羧甲基化温度及反应物配比对羧甲基取代度的影响,结果表明:在本实验条件下,49℃为适宜的羧甲基化温度,淀粉与2-氯乙醇的配比为1:3.5时羧甲基取代度最大;但产物的黏度随羧甲基化程度的提高而下降。本文进一步将HECMS与Eu配合并将其应用于纸张表面涂布中,结果显示:HECMS与HECMS/Eu(Ⅲ)使纸张的伸长率增加,但使其抗张指数降低;由于HECMS/Eu(Ⅲ)可产生荧光,故其涂布纸的白度提高。     

玉米淀粉合成丙三醇糖苷的研究

研究了反应温度、醇糖摩尔比、催化剂用量、反应时间和反应压力等因素对玉米淀粉与丙三醇反应的影响，结果表明，在较合适的工艺条件下，6．6kPa、120℃、90rain、n（催化剂）：n（糖元）：n（醇）-0．03：1：3．6，淀粉转化率可达95％。     

生物电化学法转化甘油生产1,3-二羟基丙酮

氧化葡萄糖酸杆菌中依赖辅基吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)的膜结合甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase,GDH)是酶法转化甘油生成1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone,DHA)的关键酶。以铁氰化钾为电子媒介体,采用生物电化学法,再生甘油脱氢酶的辅基PQQ,从而实现酶法循环转化甘油生产DHA。设计电耦联反应装置,在(28±2)℃,370mV电压下反应18h,DHA质量浓度达到27.21g/L,甘油转化率为52.93%。     

葡萄酒中甘油含量的测定及其在品质鉴别中的应用

使用Chem Well全自动酶联免疫生化分析仪,采用甘油激酶试剂盒,对葡萄酒中的甘油含量进行测定,实验表明,甘油含量在2.0~16.7 g/L浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9989;对不同的干红和干白葡萄酒,加标回收率为94.2%~118%;精密度和重复性(n=10)RSD%均小于5%。应用该法对部分进口和国产葡萄酒(包括采样的国产劣质葡萄酒)中的甘油含量进行了测定,通过甘油含量及甘油与酒精度的比值(简称甘酒比)对葡萄酒的品质进行了初步鉴别,效果良好。