胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的：从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定，为神经干细胞移植寻找源泉。方法：实验于2001-02／2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织，制备人胚胎大脑组织细胞悬液，免疫磁珠法分离神经干细胞，实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物，以beta actin为内参对照。结果：分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常，nestin阳性细胞纯度极高。结论：免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离，及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其意义

目的：对胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞进行分离和培养，证实其增殖潜能。方法：从孕17d的SD大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并用血清诱导其分化，通过免疫荧光化学方法研究其特性。结果：获得了大量未分化、呈悬浮生长的神经干细胞球，传数代后仍有干细胞特性，在血清诱导下，可分化为神经元及神经胶质细胞。结论：本实验成功分离胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞，为神经干细胞的基础研究奠定一定基础。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及其基本属性的观察

目的分别以单纯机械吹打法和胰蛋白酶消化法分离培养神经干细胞(NSCs),并观察NSCs的生长、增殖和分化特点。方法采用无血清培养技术从胎鼠的大脑皮层和海马通过单纯机械吹打和胰蛋白酶消化分离培养原代细胞,并加血清诱导其分化,借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞及其分化后神经元和星形胶质细胞标志蛋白的表达;并应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。结果①从胎鼠大脑皮层及海马能分离培养出具有很强增殖力的细胞,它们能稳定表达巢蛋白,经诱导分化后可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原。②与用单纯机械吹打分离细胞法相比,用胰蛋白酶消化后,在神经干细胞培养基中有很少或几乎没有未分离的组织团块,原代细胞背景更清晰。结论①应用胰蛋白酶消化,能分离培养出纯度较高的神经干细胞。②从大鼠大脑皮层及海马能成功地分离、培养出神经干细胞,它是进一步研究神经干细胞的良好材料。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的:观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。方法:实验于2004-10/2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞(家属知情同意),采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成:DMEM/F12(1∶1),表皮生长因子20μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20μg/L,重组人白血病抑制因子10μg/L,N2添加剂(终浓度为10mL/L)。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。结果:①人胚脊髓神经干细胞形态学观察:原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球,形态较规则,呈圆形,细胞边界清楚,折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后,细胞团生长速度明显加快;传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果:神经干细胞球,巢蛋白染色阳性;可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景:体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素.目的:在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成.材料:14～16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况.结果:培养48～72h细胞聚集悬浮生长,形成典犁的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达.传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5～7d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.结论:利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞.     

胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其意义

目的:对胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞进行分离和培养,证实其增殖潜能。方法:从孕17d的SD大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并用血清诱导其分化,通过免疫荧光化学方法研究其特性。结果:获得了大量未分化、呈悬浮生长的神经干细胞球,传数代后仍有干细胞特性,在血清诱导下,可分化为神经元及神经胶质细胞。结论:本实验成功分离胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞,为神经干细胞的基础研究奠定一定基础。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养大鼠胚胎脑源性神经干细胞,并进行增殖分化鉴定。方法:实验于2005-06/12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织,经机械吹打分离成单细胞后,利用无血清原代及传代培养方法,在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM/F12(1∶1)培养基中进行悬浮培养,获得具有克隆能力的细胞群;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂,换成含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM/F12培养基,将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿,诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术,用神经干细胞的特异性单克隆抗体(巢蛋白)和增殖细胞单克隆抗体(5-溴脱氧尿苷嘧啶)鉴定克隆细胞,以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术,用神经细胞的特异性抗体(神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂)鉴定分化细胞,以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。结果:①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力,表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。结论:运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞的研究是最近几年来神经科学及胚胎发育学的热点问题。人们通常认为成年哺乳动物的中枢神经系统组织是不可再生的，中枢神经系统损伤或神经系统退行性病变将只能由神经胶质爬行替代，遗留难以弥补的神经系统功能缺损。而神经千细胞特别是在成年哺乳动物中枢神经系统中发现的神经千细胞对以上观点产生了巨大的冲击。随着神经干细胞的研究深入，必将为神经系统损伤性、退行性疾病的彻底治愈，甚至神经移植治疗带来一次革命性突破。     

小鼠胚胎中脑区神经干细胞体外分离培养的特征

目的:在已成功分离培养皮质神经干细胞的基础上,体外分离培养鼠胚中脑区的神经干细胞,并进行鉴定,为中脑神经干细胞的基础与应用研究建立细胞培养平台。方法:实验于2005-11/2006-07在武汉工业学院完成。①选取孕12～13d昆明小鼠1只,处死后无菌条件下分离胚胎腹侧中脑,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在碱性成纤维生长因子和B27存在的无血清培养基中培养扩增,机械分离法传代,观察细胞生长状况。②将传至第2代的神经球以20～30个/cm2接种于置有预先经左旋多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12(不加任何生长因子)诱导分化。③采用免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞及其传代细胞的分化方向。结果:①孕12～13d的鼠胚中脑细胞体外培养36h后,可见2～5个细胞的团块;48h后有明显球状团块产生,胞间界限不很清楚,出现神经细胞球;培养6d后传代,少部分单细胞于传代2d后出现分裂相,随后渐形成细胞团及神经球,生长性状基本同原代。②将培养的神经细胞球转入有血清培养时,约1周球体可完全分化为神经细胞和胶质细胞。免疫荧光染色显示神经球细胞表达巢蛋白,且神经元特异性烯醇化酶染色和胶质纤维酸性蛋白染色均呈阳性。结论:孕12～13d鼠胚胎腹侧中脑区存在神经干细胞,这些细胞在B27和碱性成纤维生长因子存在的无血清培养基中能够成功的在体外培养和传代。     

提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法

目的：通过培养了解神经干细胞的生物学特性，着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量。方法：实验于2004-04／2005-09在锦州医学院中心实验室完成。①雌性SD大鼠35只，每日做阴道细胞涂片，排卵期雌雄合笼，以出现精栓计为受孕第0．5天。分别于孕10．5，11．5，12．5，13．5，14．5，16．5，18．5d取出大鼠胚胎体，每时间点各5只。②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞。③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液。④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达。结果：①胎龄为12．5d的胎鼠提取的神经干细胞集落最多，其次为13．5d。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球。③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞。结论：考虑到生长因子在孕13-15d能够很好地发挥作用，故选择胎龄为13．5d胎鼠作为实验材料较为合适。通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量，培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力，可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的低温保存

目的建立大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的低温保存方法,探讨经冻存后NSCs的存活及生物学特性变化。方法使用二甲基亚砜(DMSO)做NSCs的冷冻保护剂于液氮中冻存。复苏后用间接免疫荧光染色方法对细胞的存活、形态及分化能力做鉴定。结果不同冻存时间及代数的NSCs复苏后存活率无明显差异(P>0.05),且仍能在体外多次传代,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠NSCs低温冻存、复苏并不影响其原有的形态、增殖及多向分化等生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性观察

目的:分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞并观察其生物学特性。方法:实验于2004-05/2006-04在武装警察部队医学院细胞生物学实验室进行。在无菌条件下分离大鼠胫骨、股骨,用预冷磷酸盐缓冲液冲出骨髓,经Percoll梯度分离方法获得骨髓单个核细胞,接种含体积分数为0.10胎牛血清的IMDM培养基中。对单个核细胞行贴壁培养后,通过倒置光显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态学观察,流式细胞术进行细胞周期分析,细胞计数法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学染色显示c-kit表达。结果:①倒置光显微镜下观察采用Percoll(1.073g/mL)分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。②透射电子显微镜下观察骨髓间充质干细胞的核质比例较大,核仁大而明显,细胞表面有微绒毛,胞浆内可见核糖体和线粒体,其他细胞器较少,表现出未分化细胞的特征。③细胞生长曲线测定表明接种后第4天细胞进入指数增生期,至第7天进入平台期。④流式细胞术证明G2 S期细胞为11.8%。⑤体积较大的多角形细胞为c-kit阳性,体积较小的成纤维样细胞为阴性细胞,阳性颗粒主要分布在细胞膜和细胞质,细胞核未见表达,阳性细胞比率为55.3%。结论:成功地建立了一种分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法,获得的细胞生长稳定,增殖活跃,可作为组织工程的种子细胞。     

鼠胚神经干细胞体外培养方法的优化

目的:神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,但其纯化、培养技术尚不完善通过不同接种密度和传代方法,筛选优化神经干细胞的体外培养技术。方法:实验于2006-05/12在四川大学移植免疫实验室完成。①动物:选取清洁级孕12～16 d雌鼠,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:取孕鼠胚胎脑皮质,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化组织,分离神经干细胞,加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM/F12培养基.传至第3代时.调整细胞密度至1×10~7L~(-1),1×10~8L~(-1),1×10~9L~(-1),1×10~(10)L~(-1)进行培养。另取原代培养7～10 d后的神经干细胞,收集形成的细胞球,机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞.操作中避免产生气泡.使用注射器时吹打的次数保持5次。胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶,37℃水浴10min,用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打.以胎牛血清终止消化。③实验评估:观察第3代神经干细胞生长状态.MTT法检测各密度下培养1,3,5,7 d时的增殖情况。计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目,比较增殖效果。免疫荧光染包检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达。结果:①神经干细胞的培养和鉴定:从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状.并在体外大量扩增和长期存活,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达,免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞。②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响:按1×10~9L~(-1)密度培养的细胞分裂增殖最为迅速.于第7天达高峰,且克隆球生成数量明显多于1×10~7L~(-1),1×10~8 L~(-1),1×10~(10)L~(-1)密度(P均<0.05)。③不同传代方法对亚代神经干细胞克隆增殖效果的影响:采用机械吹打法传代的神经干细胞所增殖形成的细胞球结合紧密,抛光玻璃管 注射器吹打后细胞球能较好地分开.但不能完全分散成单细胞.传代后细胞能够继续生长,并形成亚代神经干细胞球。经胰酶消化的神经球在机械吹打后也不能完全形成单细胞,且其亚代克隆的形成能力明显低于机械吹打法(P<0.05)。结论:①从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞具有神经干细胞特性,可诱导分化为神经元和星形胶质细胞②1×10~9L~(-1)为最佳细胞接种密度,机械吹打法亚代克隆的活性和增殖能力明显优于胰酶消化联合机械吹打法。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养向胆碱能神经元的分化

目的在一定条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养与诱导,观察其向胆碱能神经元的分化情况,并进行鉴定。方法选取孕龄17 d的Wistar大鼠5只,利用胚胎大鼠进行脊髓源神经干细胞分离与培养,并进行神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的细胞免疫荧光鉴定。对神经干细胞进行胆碱能神经元定向诱导分化,对照组为单纯诱导培养基,其余各组以诱导培养基为基础,添加生长因子,分为维甲酸(RA)组、音猬因子(SHH)组、SHH+神经营养因子-3(NT-3)组、SHH+RA组,每组1只。细胞诱导分化14 d后,进行细胞免疫荧光染色,观察各组胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性细胞比率与细胞分化情况。结果经诱导分化后,神经干细胞向胆碱能神经元进行分化。培养14 d,大部分神经细胞从神经干细胞球中央迁出,神经细胞间突起发生交错,呈现出网状结构。经免疫荧光检测,可观察到细胞胞质呈现出红色荧光。对照组未发现Ch AT阳性细胞,SHH、RA诱导组可观察到少量的Ch AT阳性细胞,SHH+NT-3组和SHH+RA组则可以观察到较多的Ch AT阳性细胞。经统计学比较,SHH+NT-3组和SHH+RA组Ch AT阳性细胞比率均显著高于对照组、RA组、SHH组,差异均具有统计学意义(P 0.05),且SHH+NT-3组和SHH+RA组组间比较,对照组、RA组、SHH组两两比较,差异均无统计学意义(P 0.05)。结论在添加一定生长因子的条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养,可以诱导其向胆碱能神经元分化。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一股以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006—10／2007—03在重庆医科大学完成。材料：新生1～3d的Wistar大鼠全大脑。方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0．10胎牛血清的DMEM／F12培养液诱导其分化。主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经千细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、旱形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。