新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选体系的建立

目的构建基于聚合酶亚基间相互作用的双靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法将流感病毒A/PR8/34株PB2、PA基因克隆至载体pGADT7,PB1基因克隆至载体pGBKT7,将构建的酵母双杂交重组质粒PB2-pGADT7、PB1-pGBKT7和PA-pGADT7、PB1-pGBKT7分别共转化酵母AH109,利用SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培养基筛选阳性菌落。结果 PB2-PB1共转化效率为1.4×104cfu/μg,PA-PB1共转化效率为1.6×104cfu/μg;双靶点特异性的酵母双杂交系统在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal上均有兰色菌落生长;PB2、PB1、PA基因PCR结果均为阳性。结论初步构建了流感病毒聚合酶亚基间相互作用的酵母双杂交系统,可用于抗流感病毒靶点特异性的药物高通量筛选。     

甲型流感病毒PB1-F2蛋白功能的研究进展

PB1-F2蛋白是甲型流感病毒表达的第11类蛋白,含有87～90个氨基酸残基,主要定位在线粒体中,可以诱导宿主细胞线粒体途径的细胞凋亡。部分流感病毒毒株的PB1-F2蛋白可以提高流感病毒聚合酶活性,从而促进病毒在宿主细胞中复制。同时完整的PB1-F2蛋白上存在特异的抗原表位,能诱导宿主体内免疫T细胞的表达,引起其免疫水平的改变,这与二次细菌感染引发的肺损伤具有显著关联。甲型流感病毒有多种亚型,而且存在地区间差异。国内、外在关于PB1-F2蛋白的作用机制与功能方面的研究大多针对一个地区的一种亚型的流感病毒毒株,且很多都是建立在假设的基础上,因此,对于PB1-F2蛋白的作用机制及其对宿主的影响有待于开展进一步的研究。作者就甲型流感病毒PB1-F2蛋白的功能学研究进展作一综述。     

基于RNA聚合酶靶点的抗流感病毒药物筛选系统的鉴定

目的鉴定基于聚合酶亚基间相互作用的靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法挑取筛选平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal阳性单菌落（共转化质粒PB1-pGBKT7与PA-pGADT7的AH109酵母细胞）接种培养,PCR验证重组质粒共转是否成功;glass-beads法提取酵母总蛋白,Western-blot验证融合蛋白在酵母细胞中是否表达;将PB1-pGBKT7质粒PB1基因克隆至载体pAcGFP1-C,PA-pGADT7质粒PA基因克隆至载体pProLabel-C,将构建的重组质粒PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel共转染人胚肾GP2-293细胞,Co-IP验证在哺乳动物细胞中流感病毒聚合酶亚基PB1、PA具有相互作用。结果 PB1、PA基因PCR结果均为阳性;PB1-Myc融合蛋白Western-blot结果为阴性,PA-HA融合蛋白Western-blot结果为阳性;PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel重组质粒PCR验证结果 PB1、PA基因阳性;Western-blot检测PB1-GFP融合蛋白阳性;Co-IP结果表明流感病毒RNA聚合酶亚基PB1与PA在哺乳动物细胞内具有相互作用。结论基于RNA聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选系统构建成功,可以用于抗流感病毒靶点特异性的高通量药物的筛选。     

神经退行性疾病潜在致病肺炎衣原体蛋白Cpn0147酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：构建Cpn0147酵母双杂交诱饵载体,为应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的蛋白奠定基础。方法： 应用PCR扩增技术获得Cpn0147基因片段,克隆入pGBKT7载体,鉴定构建是否成功,确定构建成功后将重组载体pGBKT7-Cpn0147转入AH109及Y187酵母中,进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析。结果：Cpn0147诱饵载体构建成功,且该诱饵载体无自激活活性,对两种宿主酵母细胞无毒性。结论：诱饵载体pGBKT7-Cpn0147可用于酵母双杂交系统,为进一步筛选与之相互作用蛋白提供了实验基础。     

与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的新蛋白的酵母双杂交筛选

目的:用酵母双杂交的方法筛选与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基(FLA8)C端相互作用的蛋白。方法:设计特异性引物(上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点),扩增FLA8C端(433个氨基酸)cDNA,与穿梭载体pGBKT7连接以构建诱饵表达载体,然后转化酵母菌株Y187和AH109,Westernblot法检测诱饵蛋白在转化酵母菌株内的表达。通过自激活实验和毒性实验检测诱饵表达载体是否适合利用酵母双杂交的方法筛选相互作用蛋白。转化诱饵质粒的酵母菌株Y187与AH109(文库菌)杂交,待三叶形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序。结果:成功构建了pGBKT7-FLA8-C双杂交诱饵载体;经检测该载体的表达产物对Y187和AH109均无自激活和毒性作用,可用于酵母双杂交实验;杂交后筛选得到2个阳性克隆,测序结果显示为鞭毛结合蛋白107(FAP107)和含蛋白结合结构域的预测蛋白。结论:成功筛选得到了与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的蛋白,分别为FAP107和预测蛋白。     

E2F-1截短体的诱饵载体的构建及检测

目的 构建E2F-1截短体的诱饵载体,并进行自激活活性和诱饵蛋白毒性检测,为应用酵母双杂交系统筛选与E2F-1相互作用蛋白建立实验基础.方法 设计引物,PCR扩增E2F-1截短体,引入酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ,将E2F-1截短体连接至载体pGBKT7中,将构建成功的诱饵表达载体pGBKT7-E2F-1截短体转...     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的构建日本脑炎病毒核心蛋白（JEV C蛋白）基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均〉0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的 构建日本脑炎病毒核心蛋白(JEV C蛋白)基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应.方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoR1/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PE G/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化人酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达.结果 重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均＞0.8,在SD/-TrpPMA培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC.结论 成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pCBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pCBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础.     

HLH缺失型Id2在酵母双杂交系统中的表达及自激活检测

目的:构建HLH结构域缺失的DNA结合抑制因子(Id2)诱饵质粒,并检测其在AH109酵母中的表达及表达产物对酵母的有无毒性作用和对报告基因的有无转激活作用。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒,将构建成功的诱饵质粒转化AH109感受态酵母菌中,检测其是否具有自激活作用及对酵母的毒性作用,用Western blot方法检测其在酵母中表达的融合蛋白。结果:成功构建Id2的HLH缺失体,Id2的HLH缺失体在酵母中能够正确表达,对AH109酵母无毒性作用,对报告基因无自激活作用。结论:HLH结构域缺失型Id2蛋白适用于采用酵母双杂交系统筛选其相互作用蛋白。     

酵母双杂交筛选PA28γ相互作用蛋白

目的通过酵母双杂交筛选与蛋白酶体激活因子3(PA28γ)相互作用的肝细胞蛋白,为研究其在肝癌的发生发展中的作用机制提供新依据。方法通过酵母双杂交技术,构建PGBKT7-PA28γ蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体,以PA28γ为诱饵,在人类肝细胞cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白,并将部分阳性基因构建表达载体后与PA28γ共转染于AGS细胞进行初步验证。结果筛选出32个阳性克隆,其中有5个与肝癌细胞周期及凋亡密切相关,如ZPR9。将PWPI-PA28γ和Pcmv-myc-ZPR9共转染AGS细胞,检测发现PA28γ含量与ZPR9负相关。结论成功筛选到一些与肝癌细胞周期及凋亡相关的蛋白,为研究其机制提供了良好的线索和基础。     

COX-2诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的构建环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)筛选与COX-2相互作用的蛋白建立实验基础。方法 PCR扩增COX-2基因编码区全长,引入酶切位点EcoRⅠ、BamHⅠ,将COX-2基因克隆至载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pGBKT7-COX-2转化到酵母细胞Y190中,检测pGBKT7-COX-2在Mathmaker GAL4Two-Hybrid System3中有无自激活作用。结果 成功扩增了COX-2基因编码区全长,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确,并成功转化到酵母细胞Y190中,检测无自激活作用。结论 成功构建了COX-2的酵母诱饵载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白实验研究

目的采用Clontech公司酵母双杂交系统,筛选与血管生成素样蛋白5（ANGPTL5）相互作用的蛋白。方法将ANGPTL5基因克隆到诱饵载体pGBKT7,在证实ANGPTL5蛋白不具有自激活作用的前提下,在人HeLa细胞cDNA文库中,以酵母双杂交系统筛选与ANGPTL5相互作用的蛋白,并进行相互作用的验证。结果成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-ANGPTL5,筛选出2种蛋白与ANGPTL5相互作用,即SNARE相关蛋白（SNAPIN）和ZW10相互作用蛋白（ZWINT）。结论运用酵母双杂交技术,从人Hela细胞cDNA文库中成功获得2个与ANGpL5相互作用的蛋白质,为研究ANGPTL5的功能提供了新的线索。     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.