山奈酚对糖尿病性微血管内皮细胞RAGE表达的影响

目的:观察山奈酚(kaempferol)对糖尿病性心肌病微血管内皮细胞AGE受体(RAGE)表达的作用。方法:体外原代培养心脏微血管内皮细胞,采用牛血清白蛋白糖基化终末产物(BSA-AGEs)(100mg/L)与山奈酚(2μM,10μM,50μM)作用于心脏微血管内皮细胞(24h),免疫组化法和western法检测RAGE蛋白表达。结果:随着山奈酚浓度的增加,RAGE蛋白表达逐渐减少(P<0.05)。结论:山奈酚能够抑制AGEs诱发的心脏微血管内皮细胞RAGE的表达,从而进一步抑制氧化应激的发生。     

晚期糖基化终产物受体在脂多糖介导小鼠肺微血管内皮细胞骨架变化中的作用

目的建立一种可以得到高纯度肺微血管内皮细胞的分离方法,并分别观察野生型小鼠及晚期糖基化终产物受体
（RAGE）敲除小鼠细胞在脂多糖（LPS）刺激下细胞骨架F-actin变化情况。方法取6~8周龄野生型C57小鼠及RAGE 基因敲除
小鼠的肺,经I型胶原酶消化后,尼龙细胞筛过滤,然后采用免疫磁珠法分离原代小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,经形态学及
免疫荧光法鉴定后,以LPS（1 mg/L）刺激不同时间后用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin的变化情况。结果镜下可见原
代培养的PMVECs 呈梭形或多角形,经细胞抗Ⅷ因子相关抗原（ⅧF-Ag）染色鉴定纯度高,LPS刺激后野生型小鼠PMVEC骨架
重排,形成应力纤维,而RAGE 敲除小鼠PMVEC 骨架破坏不明显。结论采用免疫磁珠法可以获得高纯度的小鼠肺微血管内
皮细胞,且RAGE参与了LPS介导的小鼠肺微血管内皮细胞骨架破坏。
     

藏红花素对糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞凋亡的影响

目的糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)中糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGE)可引起细胞内产生过氧化物和炎症因子,导致视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cell,RMEC)凋亡,视功能破坏。文中观察藏红花素对在AGE作用下RMEC活性、凋亡比例、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产物、细胞内和上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α含量的干预,探讨藏红花素对AGE引起RMEC凋亡的保护机制。方法采用免疫磁珠法分离培养RMEC,浓度为10、50和100μmol/L藏红花素培养液作用于RMEC,观察4d内细胞增生变化并记录生长曲线。不同浓度藏红花素溶液作用于AGE处理的RMEC 12 h,锥虫蓝染色计数活细胞率,流式细胞术检测凋亡细胞比例,荧光光度计测定细胞内ROS含量,采用蛋白电泳和ELISA测定RMEC内和上清中TNF-α含量。结果 RMEC在10、50μmol/L藏红花素的培养液中可以继续增生。培养至3 d和4 d时,100μmol/L藏红花素可使细胞增生受到抑制。与对照组相比,100 mg/L AGE处理12 h和24 h后RMEC活细胞比例明显下降。10、50和100μmol/L藏红花素可不同程度保护AGE处理后RMEC活细胞比例。与对照组相比,100 mg/L AGE处理12 h后凋亡细胞比例明显升高。10、50和100μmol/L藏红花素处理12h后凋亡细胞比例均有下降。AGE处理12h后RMEC内ROS水平明显升高。10、50和100μmol/L藏红花素可不同程度抑制AGE处理后RMEC内ROS水平。AGE处理后RMEC内和上清液中TNF-α水平明显升高。10、50和100μmol/L藏红花素可明显抑制AGE处理后RMEC内和上清液中TNF-α水平。结论藏红花素可能通过抑制AGE诱导RMEC中ROS产生并减少TNF-α合成途径,防止细胞凋亡。     

糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞eNOS活性和表达的影响

目的　研究糖基化终产物 (AGEs)对内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)的活性及蛋白表达的影响。方法　用糖孵育法制备糖基化修饰的牛血清白蛋白 (AGE BSA) ,用胶原酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)。将内皮细胞与不同浓度的AGE BSA在体外分别培养 3 ,6,12 ,2 4,48h ,用同位素二步色谱法检测基础状态下与组胺刺激后的eNOS活性 ,用蛋白免疫印迹法 (Western blotting)检测eNOS蛋白表达水平。结果　基础状态下 ,HUVECs的eNOS有部分激活 ,组胺刺激后eNOS活性明显增加 (P <0 .0 0 1)。AGE BSA明显抑制基础状态下的eNOS活性和组胺刺激后的eNOS活性增高(P <0 .0 0 1) ,这种抑制作用呈时间、浓度依赖性。AGE BSA与HUVECs共同孵育 2 4h后的eNOS表达水平明显降低 (P <0 .0 0 1) ,且随着孵育时间的延长 ,eNOS表达水平进一步降低 (P <0 .0 5 ,48hvs 2 4h) ,这种抑制作用与AGE BSA的浓度有关。结论　AGE BSA明显抑制eNOS基础状态和组胺刺激后的活性增高 ,AGE BSA明显抑制HUVECs的eNOS表达 ,AGE BSA对eNOS活性的抑制作用可能与降低eNOS表达有关。     

人巨细胞病毒和糖基化终产物共同作用对血管内皮细胞的影响

目的：观察人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）和糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）共同作用对血管内皮细胞（vein endothelial cells，ECV）氧化应激的影响及对糖基化终产物受体（the receptor for advanced glycation end products, RAGE）表达的影响，明确HCMV和AGEs在致内皮细胞损伤作用中是否具有协同效应，探讨HCMV和AGEs致动脉粥样硬化 （AS）发生和发展的可能机制。方法：用HCMV和AGEs分别及共同作用于ECV，将实验对象分为：对照组、HCMV组、牛血清白蛋白（BSA）组、AGEs组、AGEs＋HCMV组5组；用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的改变；采用RT-PCR方法检测血管内皮细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染ECV后，对照组荧光强度和BSA组荧光强度均较弱，两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；AGEs组和HCMV组荧光强度强于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组荧光强度高于AGEs组和HCMV组（P<0.05），两者联合作用存在协同效应。对照组和BSA组ECV细胞RAGEmRNA均有低水平表达，两组之间比较无差异（P>0.05）；AGEs组和HCMV感染组RAGEmRNA表达量高于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组表达量高于AGEs组和HCMV组（P<0.01）。在相同病毒滴度感染的情况下，随AGEs浓度增加RAGEmRNA的表达增高，呈浓度依赖性；在相同AGEs浓度作用时，随HCMV感染滴度增加RAGEmRNA的表达水平升高，呈滴度依赖性。各组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：HCMV和AGEs均能够增强血管内皮细胞氧化应激，促进RAGEmRNA的表达，两者共同作用时呈协同效应。HCMV和AGEs有可能通过协同增强氧化应激、进一步上调RAGEmRNA的表达，介导血管内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

葡萄籽原花青素对糖基化终产物损伤内皮细胞的保护作用

目的：研究不同浓度葡萄籽原花青素(GSPC)对糖基化终产物(AGE)作用下人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制。　方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),糖孵育法制备糖基化终产物修饰牛血清白蛋白(AGE-BSA)。实验分为6组,即空白对照组、实验对照组(BSA组)、损伤组(AGE组)、损伤加入GSPC低、中、高浓度组。将200mg/L AGE作用于不同浓度GSPC培养4h的内皮细胞,继续培养24?h,以细胞生存活力、血管性假血友病因子（vWF）、一氧化氮(NO)为检测指标。结果：200mg/L　AGE抑制HUVEC生存活力,细胞增殖活力下降为正常组的90.53％,GSPC预孵育组细胞生存活力逐渐增加,分别为正常组的0.95、1.12、1.23倍;AGE组vWF生成量较正常对照组明显增加(P<0.01),NO含量较正常对照组明显降低(P<0.01)。GSPC预孵育组可显著降低增高的vWF水平,NO生成量显著高于AGE组(P<0.01), 100mg/L GSPC预处理组NO水平恢复至正常水平。结论：AGE会损伤内皮细胞,抑制内皮细胞的生存活力,减少NO的生成。GSPC可抑制AGE对内皮细胞的损伤作用,且可抑制AGE减少NO生成的作用,并呈浓度依赖性,提示GSPC保护内皮细胞免受AGE损伤的机制可能与增加内皮细胞NO生成量有关。     

糖基化终产物对内皮细胞核转录因子NF-κB表达的影响

目的：探讨糖基化终产物（AGEs)的细胞损伤机理。方法：用葡萄糖与牛血清白蛋白在体外共同孵育制备AGEs-BSA，并以荧光光谱法检测其纯度，以体外培养的内皮细胞系ECV－304为研究对象，观察不同浓度糖基化终末产物对内皮细胞核转录因子NF－κBmRNA表达的影响。结果：制备的糖基化终产物具有360nm激发峰和450nm发射峰的特性，ECV－304核转录因子NF－κB的表达水平与糖基化终产物之间存在剂量依赖关系，AGEs可使核转录因子NF－κB的mRNA表达上调，结论：分子荧光分析法是检测AGEs的有效手段，AGEs可诱导内皮细胞NF－κB的表达上调。     

肝细胞生长因子抗糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡及分子机制

目的：探讨肝细胞生长因子抑制糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡的作用及其相关分子机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，分为实验对照组、糖基化终产物及糖基化终产物＋肝细胞生长因子组，采用MTT法测定各组血管内皮细胞生长抑制率；瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化、流式细胞术测定细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法分析各组凋亡基因Ban、Bcl-2蛋白的表达及酶联反应法测定caspase-3活性。结果：糖基化终产物诱导培养的内皮细胞出现明显的凋亡形态学改变，内皮细胞凋亡率与糖基化终产物的浓度和作用时间呈依赖关系，肝细胞生长因子干预后可显著降低不同时间的内皮细胞凋亡率；肝细胞生长因子作用内皮细胞抗凋亡基因Bcl-2表达明显升高，而促凋亡基因Bax表达无明显变化；caspase-3活性显著降低。结论：肝细胞生长因子抑制糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡，其作用机制可能是上调抗凋亡基因Bcl-2水平、抑制caspase-3的激活．     

N-乙酰半胱氨酸对AGEs诱导的微血管内皮细胞VCAM-1表达的抑制作用

用流式细胞仪测定晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)刺激及N—乙酰半胱氨酸(NAC)干预前后小鼠心脏微血管内皮细胞血管细胞黏附分子1(VCAM—1)的表达，同时用放免法测定培养上清中TNF—α水平。结果发现AGEs刺激后微血管内皮细胞VCAM—1表达增加，TNF—α水平升高；NAC干预组VCAM—1表达降低，TNF—α水平下降并具有剂量依赖性。提示NAC能抑制AGEs诱导的微血管内皮细胞VCAM—1的表达，TNF—α的介导是可能的机制之一。     

预防和治疗糖尿病血管并发症的新靶点高级糖基化终产物受体

高级糖基化终产物受体(RAGE)是细胞膜上的免疫球蛋白超家族成员,可与多种相关配体结合而产生不同的病理作用.RAGE配体之一为糖化氧化产物,即高级糖基化终产物(AGE).AGE主要产生于血浆、血管壁及其他与糖尿病并发症相关的部位.AGE与其受体结合以后会上调受体的表达,启动一个正反馈环,从而使细胞持续处于激活状态,最终导致组织损伤.RAGE可表达于内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞和神经细胞等.体内外实验均证明阻断AGE-RAGE相互作用可抑制并部分逆转糖尿病大鼠早期血管通透性增高.在糖尿病伴有加速进行的动脉粥样硬化动物模型中,注射可溶性RAGE(sRAGE)阻断配体和受体的结合后,可完全抑制血管损伤的进展,同时还可以观察到在不改变血糖和血脂的情况下,动脉粥样硬化有所好转.目前的研究已表明,在糖尿病血管并发症发病机制中,RAGE起着重要作用,阻断其作用有可能成为预防和治疗糖尿病血管并发症的新途径.     

缺氧条件下视网膜微血管内皮细胞中缺氧诱导因子1和血管内皮生长因子m RNA表达的研究

目的 探讨视网膜微血管细胞在缺氧过程中缺氧诱导因子1(HIF1）和血管内皮生长因子(VEGF)基因mRNA水平表达的变化。方法视网膜微血管细胞(RECs)分别在正常氧、缺氧3h不同条件下培养后，应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法半定量测定HIF1a和VEGF基因的mRNA水平的表达。结果缺氧组RECs HIF1基因的mRNA水平表达为对照组的4．6倍。同时缺氧组RECs细胞的VEGF基因的mRNA水平表达为对照组的3倍。结论缺氧能引起视网膜微血管细胞的HIF-1及VEGF基因mRNA水平高表达，提示缺氧可能通过HIF1基因的转录途径来诱发VEGF基因的高表达导致视网膜新生血管形成。     

丙丁酚对晚期糖化终产物刺激的微血管内皮细胞血管细胞粘附分子-1表达的影响

目的 研究丙丁酚对晚期糖化终产物（AGEs)诱导的微血管内皮细胞血管细胞粘附分子1（VCAM-1）表达的影响及作用机制。方法 采用流式细胞仪测定AGEs刺激及丙丁酚作用后小鼠心脏微血管内皮细胞VCAM-1的表达，采用放射免疫法测定培养上清液中肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。结果 AGEs刺激后VCAM-1表达增加，TNF-α水平升高；丙丁酚干预组VCAM-1表达降低，TNF-α水平下降并具有剂量依赖性。结论 丙丁酚能抑制AGEs诱导的微血管内皮细胞VCAM-1的表达，TNF-α的介导是可能的机制之一。     

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞血管新生的生物学特征

[目的]观察大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的生物学特征。[方法]采用结扎法建立大鼠心肌缺血模型,植块法培养CMECs,倒置相差显微镜观察细胞形态学特征,免疫细胞化学法检测CMECs特异性抗原。实验分组将大鼠缺血CMECs作为缺血组(I组),正常大鼠CMECs作为对照组(N组),采用噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线并检测细胞增殖能力,划痕法测定细胞迁移能力,倒置相差显微镜观察管腔结构形成情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测细胞增殖相关蛋白激酶(ERK)和细胞死亡相关分子(p53)mRNA的表达情况。[结果]大鼠CMECs具备典型微血管内皮细胞特征,Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫染色鉴定均为阳性。N组和I组迁移窗口期均为第1天,成管窗口期均为第2天,N组和I组的增殖窗口期分别为第3天、第6天。两组比较,I组迁移率、增殖率和成管率均低于N组,以迁移率降低最为明显(P0.01)。I组ERK、p53 mRNA表达均高于N组(P0.05)。[结论]缺血CMECs的血管新生能力明显降低,血管新生增殖窗口期改变,可能与ERK和p53mRNA表达的变化有关,为进一步研究其基因组学及药物干预提供实验依据。     

烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及可能机制

目的 探讨烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及其机制。方法 利用激光共聚焦扫描显微镜检测人肺微血管内皮细胞肌动蛋白（F-actin）和细胞跨膜电阻仪测定细胞跨膜电位,以观察细胞通透性的改变,并利用p38 MAPK抑制剂、ROCK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂探讨其机制。结果 烟曲霉处理后肺微血管内皮细胞F-actin染色的荧光强度显著下降（P<0.01）,烟曲霉处理组也出现细胞跨膜电阻值的显著下降（P<0.01）。与单独烟曲霉处理组比较,SB203580（20μmol/L, p38 MAPK抑制剂）干预组、Y27632（20μmol/L, ROCK抑制剂）干预组以及LY317615（10μmol/L,蛋白激酶C抑制剂）干预组的跨膜电阻值均显著上升（P<0.05）。结论 烟曲霉处理致肺微血管内皮细胞通透性增加,其机制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路。     

缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞中钠氢交换体-1的表达及活性影响

目的 探讨缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(rat myocardial microvascular endothelial cells,RMMEVCs)中缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)表达以及钠氢交换体-1(hydrogen exchanger-1,NHE1)的...     

组织块法培养大鼠肺微血管内皮细胞的综合鉴定

目的 为组织块法培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)建立合理可靠的多指标综合鉴定方案.方法 采用外周肺组织贴块法培养RPMVECs,抽取组织块进行切片观察,以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照,对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构.结果 组织切片显示组织块源于外周肺组织,CD34免疫细胞化学染色阳性,植物凝集素BSI结合试验阳性,而Ⅷ因子相关抗原染色阴性,透射电镜未见Weibel-Palade小体.结论 Ⅷ因子相关抗原和Weibel-Palade小体并非RPMVECs鉴定的理想指标,联合应用外周肺组织切片、CD34和植物凝集素BSI三指标为组织块法培养的RPMVECs提供了一个简单易行、合理、可靠的综合鉴定方案.     

Gene expression profiling of the proliferative effect of periplocin on mouse cardiac microvascular endothelial cells

<正>Objective:Periplocin is an active digitalis-like component from Cortex Periplocae,which has been widely used in the treatment of heart diseases in China for many years.According to the recommendations on the cardiovascular effect of periplocin from in vivo experiments,subsequent in vitro experiments are greatly needed for the global assessment of periplocin.The objective of this study is to investigate the cell proliferation effect and the mechanism of periplocin on endothelial cells.Methods:The proliferative activity of periplocin(0.4, 2,10,50,250μmol/L;6,12,24,48,72 h) was investigated by a comparison with the well-reported cardiac glycoside,ouabain,on mouse cardiac microvascular endothelial cells(CMEC).3-(4,5-dimethylthiazolyl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT),lactate dehydrogenase(LDH) and 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU) assays were used to evaluate cell proliferation and viability.Subsequently,cDNA microarray experiments were performed on periplocin-(50μmol/L) and ouabain-(50μmol/L) treated cells,and data was analyzed by ArrayTrack software.Results:Periplocin could increase cell viability to a level lower than ouabain in the MTT analysis,but decrease LDH release simultaneously.The BrdU incorporation assay showed an increase in cell proliferation with 2-50μmol/L periplocin.Genes related to protein serine/threonine kinase were the most significantly enriched in the 160 genes identified in periplocin versus the control.In the 165 genes regulated by periplocin versus ouabain,GTP-binding was the most altered term.Conclusions:The results demonstrated the proliferation action of periplocin on CMEC.Meanwhile,its lower cytotoxicity compared to ouabain provides a new insight into the treatment of heart failure.