地高辛标记引物酶显色法检测HBV基因多态性及应用

目的　建立地高辛标记引物酶显色法 ,用于DNA芯片检测HBV基因多态性 ,并对实验条件进行优化。方法　用地高辛标记引物进行HBVDNA前C/C区和P区双重PCR ,制备含地高辛标记的DNA样品目的片段 ,并将目的片段杂交于含HBVDNA核苷酸序列野生型及突变型探针的DNA芯片上 ,用抗地高辛抗体 碱性磷酸酶进行显色 ,并转印于尼龙膜上 ,最后用光学扫描仪读取结果。结果　通过一次杂交反应同时获取HBVDNA前C/C区 (1896、1814 )、BCP区 (176 2、176 4 )和P区 (5 5 2 )位点的信息。杂交温度与时间为 4 2℃ 1h、酶作用和显色时间分别为 30min和 4 5min时结果较理想 ,采用高盐浓度洗涤获满意杂交信号 ,批内CV均在 15 %左右 ,敏感度为 2 .0× 10 3 拷贝 /ml。 5 0例乙型肝炎患者突变率 5 2 .0 % (2 6 / 5 0 ) ,以上各位点突变率分别为 34.0 %、2 2 .0 %、38.0 %、38.0 %、4 .0 %。结论　地高辛标记引物酶显色法用于芯片检测HBV基因常见位点多态性 ,简便易行 ,试剂成本显著降低 ,不需特殊设备 ,易于临床推广应用。     

聚合酶链反应检测血透患者血清中HBV DNA的临床意义

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了４２例维持性血液透析患者血清标本的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，以评价ＰＣＲ技术在调查透析中心ＨＢＶ感染的流行病学方面的应用价值。结果在４２例标本中有１７例ＨＢＶＤＮＡ阳性（４０．５％），与常规血清标志物相比较，ＨＢｓＡｇ阳性者其ＨＢＶＤＮＡ阳性率为６０．９％，而全部血清标志物均阴性者其ＨＢＶＤＮＡ阳性率为１３．３％。提示：ＰＣＲ方法是监测中心透析ＨＢＶ传染的更灵敏、更可靠手段。它也是对ＨＢＶ变异类型的鉴别及疗效评价方面的一个重要方法。     

聚合酶链反应检测血透患者血清中HBV—DNA的临床意义

乙型病毒性肝炎是维持性血液透析患者严重的感染并发症之一,它可以在患者之间交叉传播,引起透析中心肝炎的流行。而血清中HBV-DNA的存在,一直被看作是病毒复制的标志物,且与活动性肝病及传染性有关。本文采用聚合酶链反应(PCR)对透析中心42例维持性血液透析患者血清中HBV-DNA进行检测,并与常规血清标志物进行比较,以评价PCR方法在调查透析中心HBV感染的流行病学意义。 1 材料和方法 1.1 标本来源 维持性血透患者42例,男28例,女14例,平均年龄为45.3±10.8岁。透析治疗时间平均为     

DNA芯片技术及其应用

DNA芯片是近年来迅速发展起来的一项重要的DNA分析技术,它将核酸样品制备,核酸扩增和定性定量检测等一系列繁复的过程连续化和微型化,使其高度集中在一块数英寸大的固相支持物上,用于进行基因表达和检测及DNA序列分析,可极大地提高DNA分析速度和简化其分析过程,并将给分子生物实验,临床研究,新药开发等多个研究领域带来重大的冲击甚至革命。     

PCR在检测HBV DNA中的应用

ＰＣＲ在检测ＨＢＶＤＮＡ中的应用汤继光，黄立东，范友谊，李玉强，杨爱民，徐云，周光炎目前，国内文献报道用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，大多集中在方法学上［１，２］。我们用ＰＣＲ技术和酶联免疫试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测了６１２...     

芯片显色法检测HBV基因多态性临床应用

目的用芯片显色法检测HBVDNA在前C／C区、BCP区、P区基因突变来探讨拉米夫丁使用与HBV基因多态性关系。方法用含有HBV DNA前C区1896、1814和BCP区1762、1764以及P区552位点突变信息的探针芯片与HBV DNA杂交，采用显色方法判断结果，检测184例乙型肝炎患者HBV基因多态性．并将拉米夫丁治疗组和非拉米夫丁治疗组HBV基因多态性进行比较。结果184例乙肝患者中。前C区1896、1814和BCP区1762、1764以及P区552位点的突变率分别为28．8％、22．2％、25．5％、29．8％和7．0％：拉米夫丁治疗组和非拉米夫丁治疗组P区552位突变率分别为44．4％和8．7％。结论乙肝患者HBV DNA前C区和BCP区的突变与肝炎慢性化、肝硬化以及HBeAg表达有关；拉米夫丁的使用在HBV DNA P区基因突变中起重要作用。     

HBV DNA核苷酸1735～1965片段突变研究

目的　分析乙肝患者HBVDNA前C/C区和基本核心启动子区部分DNA片断突变。方法　PCR扩增HBVDNAnt1735～196 5片段,将产物进行HBVDNA测序。结果　在6 8例乙肝患者中,突变阳性率4 8. 5 % ,点突变16 8个,频率前10位的是nt176 4 ,176 2 ,1799,176 6 ,1896 ,175 4 ,1899,176 8,1814及1913,还检出鲜见报道的192 3,192 2 ,190 7等点突变。5 4例慢性肝炎和10例肝炎肝硬化患者HBVDNAnt1896 ,176 4 ,176 2点突变阳性数分别为9,19,19和3,19,19,两者差别有统计学意义(P <0 . 0 1)。结论　提示PreC/C与BCP区基因突变可能与肝实质纤维化相关联;基因测序对芯片探针设计有着十分重要的指导价值和临床意义;HBVDNA突变发生率较高,且位点众多,基因突变分析对肝炎诊疗与流行病学研究有着十分重要的意义。     

聚合酶链反应检测HBV—DNA与乙肝病毒标志物关系分析

目前HBV感染的诊断以ELISA法检测血清乙肝病毒标志物(HBVM)为依据,但ELISA仅能检出0.1～0.3Pg水平的HBV-DNA,而人在10~2即可感染发病。由于检测不敏感,使大量带有HBVDNA的患者误为正常人。分子杂交技术检测HBV-DNA的敏感性虽可达0.1～1Pg,但仍不能达到血清最低感染水平。而近年发展起来的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,可在体外将特异DNA序列呈百万倍扩增,具有敏感、特异、简便和快速等优点,可发现传统方法不能检出的HBV感染病例,并能直接反映有无病毒血症。我们应用PCR技术检测298例HBV-DNA与五项HBVM进行对比分析。     

快速反应杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的该酸探针杂交法检测产产物中的ＨＢＶ ＤＮＡ,将ＰＣＲ上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的ＰＣＲ扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素－酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为５ｆｇ,杂交时间为４０分钟。２００例临床标本检测的阳性率（２７．５％）高于琼脂糖电流法（２４．５％）。同时具有操作简便的特点,可作为ＰＣＲ扩增产物中ＨＢＶ ＤＮＡ的     

乙型肝炎病毒 DNA定值冻干血清用于荧光定量聚合酶链反应测定的研究

目的 研究冻干的定值系列血清及其在乙型肝炎病毒脱氧核糖核苷酸(HBV DNA)荧光定量聚合酶链反应测定中的应用价值。方法 制备系列冻干血清,用罗氏的内标定量方法进行定量。将定量系列血清和106拷贝/ml的样本寄发给不同试剂厂家,令其按要求稀释并检测。将定值系列血清的罗氏定量结果与各试剂检测的CT值做标准曲线,比较其定值结果与试剂盒中工作标准曲线的定值结果。结果 采用冻干定值系列血清作为荧光定量试剂盒定量测定的标准,标准曲线的线性回归系数均小于-0.99,斜率和截距与原试剂标准相近,使用该标准系列各试剂的检测结果间的变异(CV)大大降低。结论 该冻干定值系列血清可有效地用于临床HBV DNA的定量测定。     

乙型肝炎病毒前C区基因变异检测及意义

目的　用PCR产物直接测序法检测乙型肝炎病毒前C区基因变异,以指导临床合理使用抗病毒药物。方法　应用套式聚合酶链反应扩增包括前C区基因在内的DNA片段,采用Sanger双脱氧链末端终止法,在ABIPRISM310型核苷酸序列分析仪上直接测序。结果　对8例临床标本进行测序,检出5例G     

乙型肝炎感染者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物（HBVM）表现模式的相关性。方法血清HBV DNA定量榆测采用PCR ELISA法，HBVM采用ELISA法。结果在HBVM阳性的430例血清中，有232例HBVDNA阳性，占54，0％。血清HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性者HBVDNA阳性率占94．8％，≥106copies／ml占65．9％；HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA阳性占29．4％，≥106copies／ml占17，5％。结论血清HBVM阳性患者中约54．0％的血清HBV DNA阳性，且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率明显高于抗-HBe阳性者；在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBVDNA阳性者。     

血清中HBV DNA与HBsAg、HBeAg关系的评价

目的：探讨血清中HBsAg、HBeAg与HBV DNA的关系,为乙型肝炎的诊治提供科学依据。方法对927例患者的HBsAg、HBeAg和HBV DNA间的关系进行了回顾性分析。结果927例血清标本中,HBsAg和HBeAg均阳性组中HBV DNA阳性率为最高,为70.44%。不同浓度HBV DNA组与HBV DNA阴性组比较,阴性组的HBeAg阳性率明显低于其他各组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论在检测HBsAg和HBeAg定量的同时联合检测HBV DNA,有助于更准确判断病毒复制情况,进行疗效监测,优化治疗方案。     

HBV前S1抗原与HBV DNA联合检测的临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV pre-Sl)、HBV DNA与HBV表面标志物(HBV-M)的关系。方法从临床乙型肝炎标本中筛出HBsAg阳性病例329例,采用ELISA法检测乙肝血清标志物和前S1抗原,荧光定量PCR法检测标本HBV DNA。结果血清HBeAg抗原阳性组,HBV DNA和pre-Sl的阳性率分别为97.2%和90.0%,而HBeAg抗原阴性组的HBV DNA与pre-Sl阳性率分别为42.9%和37.0%,HBeAg阳性患者血清的HBV DNA与pre-Sl的阳性检出率明显高于HBeAg阴性患者。结论 HBV pre-Sl和HBV DNA在各组中阳性检出率有较高的一致性,pre-Sl在一定程度上可替代HBV DNA。pre-Sl与乙肝血清标志物联合检测能为乙肝患者病毒复制、肝功能损伤提供有价值的实验室依据,同时有助于慢性乙肝患者疗效考核和预后判断。     

乙型肝炎病毒检测YMDD基序变异情况分析

目的调查乙肝患者HBVDNAYMDD基序突变情况，为医院肝病临床治疗前评估、优化治疗方案提供依据。方法收集2012年1月～7月间乙肝患者580份血清标本，进行HBVDNA检测和YMDD基序变异检测，并进行统计学分析。结果580份标本有351份血清中HBVDNA〉1×103 copies／ml，发生YMDD基序突变的血清为43份；不同病毒载量区间YMDD基序变异患者比例之间差异有统计学意义，YMDD基序变异患者分布与病毒载量高低存在负相关关系（卡方检验和Pearson相关性检验P均〈0．05）；高变异病毒载量的患者之一在接受ETV和ADV优化治疗3个月后，病毒栽量降至105copies／ml。结论YMDD基序变异会导致患者对NA类药物的敏感性降低，及时的基因突变检测能够对耐药进行预测，预防耐药发生，为肝病治疗方案的优化提供依据。     

COBAS Taqman HBV DNA的方法学验证

目的 评估COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能及临床应用.方法 依据美国国家临床实验室标准化委更会(NCCLS)制订的临床化学方法评价方案(evaluation protocols),通过精密度、携带率、线性评价、仪器同比对、参考范围确认等试验,对COBAS Taqman HBVDNA分析系统的性能参数进行了评估.结果 COBAS Taqman分析系统批内变异6.9%～8.6%,批间变异10.5%～18.7%,总变异10.8%～20.2%,线性范围6.0～101 IU/ml,回收率98.7%～104.5%.仪器间比对相关性较好(r2=0.998).结论 COBAS Taqman HBV DNA分析系统性能指标符合要求,操作简便、快捷,动力学范围广,是目前理想的HBV DNA检测方法.通过此次验证,建立了一套简便的核酸检测方法学评价方案,有利于临床实验室标准化操作的实施.     

COBAS Taqman HBVDNA的方法学验证

目的 评估COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能及临床应用。方法依据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制订的临床化学方法评价方案（evaluation protocols），通过精密度、携带率、线性评价、仪器间比对、参考范围确认等试验，对COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能参数进行了评估。结果COBAS Taqman分析系统批内变异6．9％～8．6％，批间变异10．5％～18．7％，总变异10．8％～20．2％，线性范围6．0～10^7IU／ml，回收率98．7％～104．5％。仪器间比对相关性较好（r^2=0．998）。结论COBAS Taqman HBV DNA分析系统性能指标符合要求，操作简便、快捷，动力学范围广，是目前理想的HBV DNA检测方法。通过此次验证，建立了一套简便的核酸检测方法学评价方案，有利于临床实验室标准化操作的实施。     

HBV-DNA定量与乙肝病毒感染免疫学检测结果对比分析及意义

本文采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)和ELISA两种方法同时检测了 310份血清 ,并对结果进行了对比分析 ,结果显示 :80例HBsAg (+)、HBeAg (+)、HBcAg (+)组的血清HBVDNA检出率为 92 5 % (74例 ) ,平均拷贝数为 4 10× 10 10 /ml,6 8例HBsAg (+)、HBeAb (+)、HBcAb (+)组血清HBVDNA检出率为32 35 % (2 2例 ) ,平均拷贝数为 1 31× 10 9/ml,70例HBsAg (+)、HBeAb (+)组血清HBVDNA检出率为45 71% (32例 ) ,平均拷贝数为 4 0 8× 10 8/ml;32例HBV M全阴性组血清HBVDNA检出率为 6 .6 7% (2例 ) ,平均拷贝数为 1 5 4× 10 8/ml。结果表明 :HBV -M阴性的病人也可能有HBVDNA阳性 ,因此为临床提供HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗 ,应选择乙肝两对半标志物检测的同时做PCRHBVDNA定量检测     

乙型肝炎病毒X基因部分区段及其编码氨基酸变异的分析

目的进一步探讨X基因在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者疾病转归中的作用。方法采用巢式PCR(nested-PCR),用型特异性引物对标本进行基因分型,针对基因分型成功的标本,采用巢氏PCR扩增X基因部分区段,对有特异性条带的扩增产物进行序列测定,测序结果用相关软件进行处理,翻译成蛋白质后与文献中已经公布的和疾病相关的变异位点进行比对并进行统计。结果测序成功的41人份标本翻译成氨基酸后,与文献中已报道的与疾病相关的X蛋白变异位点进行比较,发现17个样品的变异与肝细胞癌相关,9例X基因中的插入和缺失变异,会导致X蛋白整个读码框架的改变。结论本实验对HBV感染者的疾病转归进行了初步预测,通过追踪研究可对X基因在致病过程中所起的作用进行更为科学的调查和研究。