多药耐药基因(MDR1)转染小鼠骨髓造血细胞表达及功能研究

目的：探索含人多药耐药基因（ＭＤＲ１）全长ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染小鼠骨髓造血细胞转染时间及转染效率的关系。方法：采用逆转录病毒上清法转染小鼠骨髓造血细胞，依据转染时间不同分为２日组及４日组，分别行ＰＣＲ法检测外源ＭＤＲ１基因；免疫组化法检测ＭＤＲ１基因表达，柔红霉素排出试验检测表达外源基因的功能。结果：ＰＣＲ方法证实转入的外源ＭＤＲ１基因可整合入小鼠骨髓造血细胞基因组中；免疫组化法检测转染率最高达３３％，转染４日组转染率大于转染２日组转染率（Ｐ＜０．０５）；柔红霉素排出试验证实转入外源基因表达产物可行使正常功能。结论：逆转录病毒上清法可有效转染外源ＭＤＲ１基因入骨髓造血细胞中；表达产物可行使正常生理功能；在转染４天时间内，转染率随转染时间延长而增高。     

荷瘤小鼠多药耐药(MDR1)基因转染后P-gp体内表达的研究

目的：探讨恶性肿瘤MDR1基因治疗过程中，MDR1基因在体内的表达。方法：骨髓造血细胞转染MDR1基因后，程序性移植入预先照射亚致死剂量^60Co-γ射线的荷瘤小鼠，取骨髓造血细胞、肿瘤实体做P-糖蛋白免疫组化并做RT-PCR以观察MDRI基因的表达情况。结果：各剂量组MDRI基因转染后随时间骨髓造血细胞P-糖蛋白表达逐渐增加，各剂量组之间无明显差异。P-糖蛋白表达化疗剂量较大组明显高于化疗剂量较小组。结论：MDRI基因转染在骨髓造血细胞有较高表达，对肿瘤实体、肝脏、肾脏P-糖蛋白表达无影响。     

多药耐药的研究进展

目的：探讨肿瘤多药耐药的研究新进展。方法：阅读国内外有关文献并进行综述。结果与结论：恶性肿瘤的综合治疗中化学疗法是重要手段之一,然而肿瘤的原发或继发对化疗药物的多药耐药(MDR)是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。     

P-糖蛋白在血脑屏障上的作用及其对肿瘤多药耐药的介导机制

综述P-糖蛋白(P-gP)的生物学特性及其在血脑屏障上对药物通透性的影响。说明P-gP是一种能量依赖性主动外排泵。mdrl基因编码的P-糖蛋白(P-gP．P170)过度表达可能介导了肿瘤细胞的多药耐药(MDR)。指出,进一步研究对于提高抗癌药的疗效,改善药物的中枢作用和毒性,提高机体正常细胞的抗毒能力,减少毒副反应等都有重要的意义。     

多药耐药mdr-1基因体外转染兔骨髓造血细胞及其表达与功能的研究

目的：探讨浓缩病毒上清转染法在体外将多药耐药mdr—1基因转入兔骨髓造血细胞的条件及检测转染后mdr—1基因在兔骨髓造血细胞中的表达及功能。方法：用秋水仙碱(90ng／ml)筛选含人类全长mdr—1cDNA的产病毒包装细胞PA317—HaMDR1／A1后进行细胞培养并制备浓缩病毒上清。采集新西兰大白兔骨髓并分离富含造血细胞的单个核细胞。骨髓造血细胞与浓缩病毒上清及细胞因子组合共培养。采用免疫组织化学法检测转染率，PCR法检测外源性mdr—1基因的整合，柔红霉素(daunorubicin DNR)泵出试验检测导入的mdr—1基因的功能。结果：秋水仙碱筛选后，产病毒包装细胞P糖蛋白(P-g;ucp[rpteom P-gp)表达增强：外源性mdr—1基因能成功的导入兔骨髓造血细胞，转染2日、4日、6日的转染率分别为22％、37％、39％，但转染4日组细胞生长状态最好；转入的mdr—1基因能发挥药物外排泵的功能。结论：采用浓缩病毒上清转染法能成功的将外源性mdr—1基因导人兔骨髓造血细胞中并获得稳定的功能性表达，为进一步研究mdr—1基因转染骨髓造血细胞后自体回输在大剂量化疗中对骨髓保护作用的研究提供了依据。     

肿瘤细胞多药耐药基因研究进展

本文综述了近年来肿瘤多药耐药基因的研究进展，包括多药耐基因家庭，ＭＤＲ：基因及其所编码的Ｐ－糖蛋白的结构和功能，以及目前在胃肠道肿瘤和肺癌检测中的应用。逆转肿瘤多药耐药是临床急待解决的问题。     

青蒿素对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞的逆转作用

目的探讨青蒿素在乳腺癌多药耐药中的应用。方法采用MTT法观察青蒿素联合阿霉素(ADR)对乳腺癌耐药株MCF-7/ADR细胞生长增殖的影响;应用流式细胞技术测定青蒿素联合ADR对MCF-7/ADR细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达的影响。结果 10、20、40μmol/L青蒿素实验组的细胞耐药逆转倍数分别为1.53、1.90和3.62倍。青蒿素联合ADR可抑制MCF-7/ADR细胞膜P-gp蛋白的表达,0、10、20、40μmol/L青蒿素作用后的细胞表面P-gp表达阳性率分别为(33.41±4.63)%、(23.07±5.48)%、(21.82±3.87)%和(16.62±1.27)%,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05);各组细胞内总P-gp的表达水平分别为(37.19±5.16)%(、35.30±4.77)%(、37.45±5.19)%和(34.98±3.50)%,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论青蒿素与ADR同共作用于MCF-7/ADR细胞,使细胞对ADR的敏感性增高,青蒿素具有部分逆转MCF-7/ADR细胞耐药的作用,其逆转作用机制可能是通过影响细胞质和细胞膜之间的P-gp交换,降低细胞膜上P-gp表达水平,提高药物在细胞内的聚集,增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。     

采用多药耐药基因mRNA转染人单个核血细胞提高对化疗药物耐药性的体外研究

目的：采用将人多药耐药基因（MDR1）mRNA导入人单个核血细胞的方法,观察跨膜糖蛋白(P-gp)在转染后单个核血细胞中的表达和功能情况,并初步探讨此方法中影响P－gp表达和功能的因素。方法：体外分别合成无5′和3′UTR（非翻译区）的MDR1 mRNA[pGEM5Zf( )-MDR1]和使用Xenopusβ-globin的5′和3′UTR替代野生型5′和3′UTR的MDR1 mRNA(pT7TS-MDR1),从而构成两个试验组。然后利用脂质体为介质转染富含造血细胞的人单个核血细胞, 式细胞技术对MDR1基因的翻译产物P-gp的表达和功能进行检测。结果：转染后12h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．16％,pGEM5Zf( )-MDR1组为8．94％,pT7TS-MDR1组为19．14％;转染后72h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．12％,pGEM5Zf( )-MDR1组为6．12％,pT7TS-MDR1组为25．29％,pT7TS-MDR1组为35．02％。结论：转染后12h及72h两试验组都表现出P-gp的高表达,并且以pT7TS-MDR1组为优;转染后细胞对P-gp的表达及存在可以维持至少72h;表达的P-gp具有外排泵功能。MDR1 mRNA转染人单个核血细胞具有提高其对化疗药物耐药性的潜质。     

多药耐药基因/P-糖蛋白介导的多药耐药逆转策略的研究进展

化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一,然而化疗过程中产生的多药耐药(MDR)却是造成化疗中断、导致治疗失败的主要因素。目前的研究表明,肿瘤细胞产生MDR的原因和机制非常复杂,其中多药耐药基因(MDR1)的过度表达最主要也最为经典。MDR1基因编码的P糖蛋白(P gp)是一ATP依赖性的药物泵,其可以通过水解ATP提供的能量,将进入细胞内的药物泵出细胞,使得细胞内药物浓度不断下降,最终造成其细胞毒作用减弱甚至丧失,从而出现耐药。1981年Tsuruo等[1]开始尝试用低剂量的维拉帕米抑制P gp对长春新碱的外排作用,以增加其在细胞内的有效浓度,…     

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1a-mSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BM-MNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。     

MDR1基因修饰的自体骨髓移植后体内表达及时限的研究

目的 研究多药耐药基因1(multidrug resistanle gene 1, MDR1)转染的骨髓单个核细胞自体移植后,外源性MDR1基因在骨髓中的功能性表达及时限.方法 体外浓缩病毒上清转染法将MDR1基因导入兔骨髓单个核细胞;经大剂量环磷酰胺化疗预处理后,将转染的骨髓单个核细胞行自体骨髓移植;采用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素(daunorubicin, DNR)排出试验检测MDR1基因在受体骨髓中的整合及功能性表达.结果 自体骨髓移植后1～4个月,PCR法检测到外源性MDR1基因在骨髓细胞基因组中的整合;免疫组化法测得骨髓单个核细胞中P-gp阳性率分别为9.5%、8.5%、6.0%、3.5%;柔红霉素排除试验检测到定植的MDR1基因能功能性的表达.结论 转染MDR1基因的骨髓单个核细胞自体移植后,MDR1基因能定植于骨髓中并功能性的表达4个月.     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.     

大鼠骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死

目的:探讨大鼠骨髓单个核细胞(mononuclear bone marrow cells,MBMCs)移植方法对梗死心肌的治疗效果.方法:无菌条件下取成年雄性近交系Wistar大鼠股骨和胫骨,常规抽取骨髓,分离制备MBMCs悬液.将成年雄性近交系Wistar大鼠46只随机分为空白对照组(组Ⅰ,n=10)、梗死对照组(组Ⅱ,n=18)、细胞移植组(组Ⅲ,n=18).用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,在建模后2周分别将10μl MBMCs(6×106)悬液和等量磷酸盐缓冲液(PBS)植入组Ⅱ和组Ⅲ的梗死周边区.用心脏超声观察细胞移植后4周的心脏功能改变,用免疫荧光和免疫组化及电镜观察移植细胞在心肌梗死区及梗死周边区的存活、增殖和分化情况.结果:MBMCs移植4周后,移植组超声检查左室功能重建指标如左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、左室前壁厚度(LVAWT)均较梗死对照组改善明显(P＜0.05);移植组血流动力学检查指标如左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室舒张压力时间变化最大速率(±dp/dtmax)也优于梗死对照组(P＜0.05).MBMCs移植6周后,大鼠心肌梗死区有移植细胞存活、增殖,并分化为有心肌细胞特征的细胞.结论:实验证实用MBMCs移植治疗心肌梗死,可以明显改善梗死后心脏功能.这一效果可能与MBMCs移植相关的心肌再生和新生血管形成有关.     

急性苯中毒对小鼠骨髓细胞超微结构的影响

为观察急性苯中毒对小鼠骨髓细胞超微结构的影响，用ＢＡＬＢ／ｃ小白鼠做了急性毒性实验。结果表明，苯中毒影响了多个系统的血细胞，变性、坏死的血细胞多为分化成熟中的细胞，而且，对粒系细胞影响最为严重，超微结构的改变与末梢血粒细胞减少相一致。有孔毛细血管扩张，血管内皮细胞呈变性改变，另外，在某些粒细胞浆中发现一些巨大杆状包涵体，无论在外形和结构上都与Ａｕｅｒ小体相似。     

hPDGF-A/hBD2双基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨hPDGF-A/hBD2腺病毒双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs)后,对BMSCs本身生物学特性的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,应用GFP标记的腺病毒表达载体系统Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2.以脂质体法转染293细胞,再以病毒上清液感染BMSCs,对转染目的 基因后的BMSCs进行形态学观察,绘制生长曲线,测定其细胞周期以及向成脂、成骨、成肌诱导分化和鉴定.结果 hPDGF-A/bBD2双基因成功转入BMSCs后,未发现其对细胞活性有明显作用,基因修饰后的BMSCs仍具有成体干细胞所具备的增殖能力,以及向成脂、成骨、成肌等方向分化的潜能.结论 BMSCs是重组腺病毒转染的良好靶细胞,hPDGF-A/hBD2基因修饰的BMSCs仍可作为满意的细胞治疗的种子细胞.     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.