细菌人工染色体及其在马立克氏病病毒研究中的应用

简要介绍了细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体及其修饰技术,重点综述了BAC在马立克氏病病毒基因功能、疫苗研究中的应用。细菌人工染色体是近十几年发展起来的一种新型DNA克隆载体系统,具有操作简单、遗传稳定、容量大等明显的优势,主要用于构建基因组文库、转基因动物模型、分子克隆化病毒等。     

我国濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库的构建及应用

细菌人工染色体(BAC)是新近发展起来的一种载体系统,具有克隆容量大,遗传特性稳定,转化效率高,易于操作等优点.在基因组文库构建和基因的快速克隆等方面已得到广泛应用.濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库构建的目的在于有效、永久保存和利用其基因资源、快速克隆重要经济和抗逆性状基因以及为广泛、深入开展分子生物学研究提供宝贵的材料.     

重组禽α疱疹病毒研究进展

禽α疱疹病毒可以引起多种家禽重要传染病,重组病毒是研究其基因组结构功能和新型基因工程疫苗的有效手段.文章综述了禽α疱疹病毒转移载体的构建和同源重组方法、感染性细菌人工染色体系统、基因缺失疫苗和重组活载体疫苗的最新进展.     

细菌人工染色体荧光原位杂交技术的应用

目前,覆盖人类、植物、畜禽、微生物等100多种物种全基因组的细菌人工染色体文库在不同时间、不同群体中相继产生,为物种基因资源的保存、基因组学和后基因组学的研究提供了可靠的材料。细菌人工染色体与荧光原位杂交技术的结合能够将物种的大片段基因组DNA杂交在染色体上,确定基因或标记物在染色体上的物理位置,从而成为细胞和分子生物学领域中必不可少的工具。论文对细菌人工染色体荧光原位杂交技术在染色体结构与核型分析、疾病与肿瘤病原学研究、基因和标记物的定位与细胞遗传图谱绘制、基因组比较作图及物种进化中的应用和发展进行了综述。     

一种基于无缝克隆构建重组杆状病毒的方法

一些病毒复制过程涉及到断裂双链DNA的修复,主要有同源重组和非同源的末端连接2种修复形式。基于这种修复机制建立了构建重组杆状病毒的无缝克隆方法,采用该方法构建重组病毒的2个主要元件是:线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段。杆状病毒载体经Bsu36Ⅰ酶切后产生2个末端,即切短了的orf1629 3'末端和细菌人工染色体(BAC)末端。其中,含克隆目的基因的重组拯救DNA片段通过同源臂同源重组修复病毒载体orf1629缺失的3'端序列,并通过细胞内的非同源末端连接修复细菌人工染色体片段(BAC)Kanr末端,从而使载体环化产生重组杆状病毒。应用该方法构建重组杆状病毒无需构建重组载体,无需进行重组后筛选,具有成本低、效率高的特点。     

细菌人工染色体技术研究进展

细菌人工染色体是一种新发展起来的DNA栽体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点.在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用.笔者综述了近年来发展起来的对BAC进行分析和修饰的一些方法.     

编码基因完整的伪狂犬病毒细菌人工染色体的构建

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶AcclⅠ处理过的病毒全基因组连同转移载体共同转染BHK21细胞,获得重组病毒;利用PCR检测、电镜观察及生长曲线测定对野毒与重组毒的基本特性进行了比较。结果表明:重组病毒可以稳定地表达绿色荧光,BAC在传代过程中能够稳定存在;重组病毒在电镜下的形态与野毒未见差异,其生长曲线也基本同野毒吻合。说明成功构建的编码基因完整的PRV细菌人工染色体可用于该病毒的结构生物学及致病机理研究。     

绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化

近年来,细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一,它以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色体BAC文库的构建条件进行了研究,用HindⅢ部分酶切绒山羊基因组,脉冲场凝胶电泳分离大片段DNA,以电洗脱法回收DNA后,与BAC载体连接,将连接产物点透析后,电转化DH10B感受态细胞,最后对转化的片段小提质粒进行NotⅠ酶切,脉冲电泳鉴定其大小。结果表明,本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率,是较好的用于构建大基因组文库的方法。     

质粒特性和载体质粒

分子生物学研究证明,染色体是基因的载体,基因的核苷酸序列按一定顺序和结构排列在染色体上。这些基因和核外遗传因子,又称细胞质遗传基因组,能控制生物的一切遗传。核外遗传因子包括线粒体,中心粒、动粒和质粒。而研究较多的则是细菌质粒,它是基因工程操作中,携带外源基因,转化受体细胞的运载工具之一,故称载体(Vector)。细菌质粒是微小而裸露的核外遗传因子,呈共价闭合的环状DNA分子。细菌是质粒的宿主,质粒在细胞质中只有染色体的0.2％—3％,分子量约为0.34～170×     

湖羊染色体快速制备法及其核型比较

<正> 染色体是遗传物质的载体,对机体性状的传递有重要作用.通过对染色体的检测,在家畜的选种、育种及疾病诊断等方面均具有重要意义.目前,在染色体标本制作方法上,多采用血培养法.此法虽然精确性高,但所需设备复杂,药品昂贵,制作时间又长,还常因培养所产生的人工效应而影响染色体的观察.用非培养法制得的染色体标     

猪流行性腹泻病毒反向遗传学及其研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是高度接触性肠道传染病猪流行性腹泻（PED）的病原,是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约28 kb。2010年以来,PEDV G2型高致病性毒株不断发生变异,给全国乃至全球的养猪业造成巨大的经济损失。反向遗传学系统,即构建RNA病毒的全长感染性克隆。近年来,PEDV主要基于靶向RNA重组、BAC系统和体外连接3种方法来建立全长感染性cDNA克隆。文章简述了反向遗传学的原理和方法。靶向RNA重组利用冠状病毒RNA的高同源重组的特点来实现病毒的拯救;BAC系统利用pBeloBAC11载体克服PEDV基因组中含有的毒性序列所导致的cDNA在高拷贝质粒中不稳定的困难;体外连接技术主要利用PEDV基因组本身存在的限制性内切酶的酶切位点或通过改造的酶切位点在体外将病毒分片段地连接成全长的cDNA克隆。另外,文章还总结了近年来基于反向遗传学技术的PEDV相关的研究进展。PEDV反向遗传学是研究PEDV病毒基因组结构功能及设计减毒活疫苗的有效工具,利用反向遗传学技术探究S基因等毒力相关基因,探究其突变或缺失对病毒致病机制的影响,揭示PEDV毒力衰减的分子机制,有望设计出具有良好免疫原性且避免毒株返毒和重组减毒活疫苗。总之,PEDV反向遗传学是研究PEDV基因组结构及功能、病毒宿主相互作用及致病机制的一种重要方法,同时也是设计PEDV减毒活疫苗一种合理有效的途径。     

反向遗传技术在传染性法氏囊病病毒研究中的应用

传染性法氏囊病是鸡的最严重疾病之一,其病原是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV),IBDV基因组为两片段双链RNA,变异株和超强毒株的出现,给传统的疫苗免疫带来了新的挑战,因此,加强对IBDV的基础研究是控制该病的关键.RNA的结构不稳定成为阻碍RNA病毒研究的主要障碍,近年来兴起的反向遗传技术将RNA病毒的基因组转化为cDNA,从而使RNA病毒的基因操作成为可能,也使RNA病毒的研究获得了快速的发展.文章就传染性法氏囊病病毒反向遗传操作研究的意义、方法、概况及相关分子生物学进行了全面综述.     

反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用

RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来,RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。     

反向遗传操作技术在猪瘟基础理论研究中的应用

反向遗传操作技术的问世为RNA病毒的研究铺平了道路,研究人员根据需要在DNA水平上对RNA病毒进行加工和修饰,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在猪瘟病毒上应用以来,在对猪瘟病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因等方面的研究已取得明显进展。本文就反向遗传操作技术在猪瘟病毒基础理论研究中的应用作一综述,通过了解病毒基因组的功能、病毒与宿主致病力的关系以及病毒增殖特性等,为研究开发理想猪瘟标记疫苗开拓思路。     

小反刍兽疫病毒反向遗传学研究进展

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的山羊、绵羊等小反刍动物的急性、高度接触性传染病。反向遗传学是在获得生物基因信息的基础上,对基因进行突变、缺失等操作,进而研究基因变化对表型的影响。本文综述了包括PPRV在内的单股负链RNA病毒反向遗传学的最新研究进展,以期为PPRV及同科属病毒的反向遗传操作系统的建立提供新的思路。     

The reverse genetics applied to fish RNA viruses

ABSTRACT: Aquaculture has expanded rapidly to become a major economic and food-producing sector worldwide these last 30 years. In parallel, viral diseases have emerged and rapidly spread from farm to farm causing enormous economic losses. The most problematic viruses encountered in the field are mainly, but not exclusively, RNA viruses belonging to the Novirhabdovirus, Aquabirnavirus, Alphavirus and Betanodavirus genera. The recent establishment of reverse genetics systems to recover infectious fish RNA viruses entirely from cDNA has made possible to genetically manipulate the viral genome. These systems have provided powerful tools to study all aspects of the virus biology and virus-host interactions but also gave the opportunity to use these viruses as live vaccines or as gene vectors. This review provides an overview on the recent breakthroughs achieved by using these reverse genetics systems in terms of viral protein function, virulence and host-specificity factor, vaccine development and vector design.     

流感病毒H3N2神经氨酸酶双点突变对病毒抗药性影响的研究

为验证流感病毒H3N2神经氨酸酶上2个抗药性的关键位点,利用反向遗传学手段,8个质粒共同转染293T细胞,包装带有双点突变(第119位氨基酸由E突变为V,第222为氨基酸由I突变成L)、单点突变和野生型的流感病毒H3N2;在MDCK细胞中传代包装成的H3N2病毒,检测不同感染时间和有无抗流感病毒药物(奥司他韦)存在下病毒的滴度。结果表明,野生流感病毒H3N2和其突变株包装成功,第119位氨基酸单点突变型滴度与野生型的相近,而第222位氨基酸单点突变和双突变型滴度要比野生型的低;双点突变株相比野生株具有很高的抗奥司他韦的生物活性,而单点突变型不具有抗药活性。本试验成功证明了H3N2神经氨酸酶上2个位点(第119和222位氨基酸)对病毒抗药性起到关键的作用,且只有双点同时突变的条件下,病毒才会有抗奥司他韦的生物活性。     

鸭源H5亚型禽流感全禽源分子标记疫苗候选株的构建

为了开发用于南方水禽且适合血清学监测的H5亚型禽流感疫苗,作者通过反向遗传技术,删除A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1,S株)病毒HA编码多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,分别与A/duck/England/1/1956(H11N6,E株)和A/Chicken/Shanghi/F/98(H9N2,F株)的NA组合,再以本室禽源高产病毒F株的6个内部片段为骨架,构建全部基因都来自禽流感的疫苗株.成功拯救出2株重组病毒,分别命名为rH5N6/F和rH5N2/F,并引入分子标记N6和N2.重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,且rH5N6/F更适合在鸡胚中生产,对SPF鸡和鸡胚无致病性.重组病毒在clade2.3.4毒株中具有很好的抗原代表性,引入的分子标记有利于血清学监测的区分,为防控水禽H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株.     

表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建

通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。