两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较

目的比较两种常用转染试剂转染小干扰RNA(siRNA)至悬浮细胞的转染效率及对细胞毒性的影响。方法以羧基荧光素(FAM)标记的siRNA为报告基因,以lipofectamine 2000和siPORT NeoFX为转染试剂,用流式细胞仪检测转染效率,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞存活率。结果 siRNA>100 nmol/L时,lipofectamine 2000的转染效率高于siPORT NeoFX(P<0.05);si RNA<100 nmol/L时,前者低于后者(P<0.05)。siRNA终浓度及转染试剂用量相同时,lipofectamine 2000组HL-60细胞存活率与SiPORT NeoFX组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在使用高浓度si RNA时,lipofectamine2000对HL-60细胞有较高的转染效率和较小细胞毒性。     

非病毒载体介导神经干细胞基因转染的效果观察

目的 寻找较佳的神经干细胞非病毒载体基因转染方法。方法 采用磷酸钙、不同种类脂质体、Fugene 6和Nucleofector法将绿色荧光蛋白基因转染于神经十细胞，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染结果。结果 荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果表明，转染效率从高到低依次为Nucleofector法、DMRIE-C介导、FuGene6介导、Lipofectamine和磷酸钙转染，组间均存在显著差异。结论 Nucleofector法和DMRIE-C脂质体介导是神经干细胞基因转染的较佳方法。     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.     

转染试剂JetPEI和Lipofectamine Plus对NIH3T3转染效果及毒性的比较和评价

目的 比较及评价两种转染试剂JetPEI和Lipofectamine Plus对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的转染效果及毒性.方法 分别用阳离子聚合物JetPEI和阳离子脂质体Lipofectamine Plus将表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒转染NIH3T3,24 h后,用流式细胞仪检测转染效率;分别用JetPEI和Lipofectamine Plus将75 nM 24 bp的双链寡脱氧核苷酸(ODN)转染NIH3T3,12 h后,用激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞内的分布;分别将转染相同量DNA的JetPEI和Lipofectamine Plus加入细胞培养基中,48 h后,用WST-8试剂检测其对细胞的毒性.结果 对于大分子质粒,JetPEI的转染效率更高;对于小分子ODN,JetPEI包裹ODN后形成的颗粒更小,更易于进入细胞核内;转染相同量的DNA,JetPEI对细胞的毒性更小.结论 对于转染NIH3T3,JetPEI是一种更理想的转染试剂.     

RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡

目的研究RNA干扰效应对胶质瘤C_6细胞株胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达的抑制作用及其对C_6细胞凋亡诱导的作用。方法体外化学合成靶向IGF-1基因的小干扰RNA(siRNA),采用脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C_6细胞株,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组；同时使用绿色荧光素标记的siRNA异硫氰酸荧光素(FITC)-siRNA转染细胞,于荧光显微镜下观察siRNA转染效率；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测siRNA对IGF-1基因表达的抑制作用；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光,脂质体Oligo- fectamine~(TM)2000的转染效率可＞95%；化学合成的siRNA明显抑制IGF-1 mRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF-1 mRNA表达水平可下调约40%～70%,流式细胞术检测转染IGF1-siRNA细胞凋亡率为14．14%,明显高于对照组的0．95%。结论在细胞水平上,化学合成的靶向IGF-1的siRNA可明显抑制IGF-1基因的表达,引致胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步利用RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

干扰EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潜在的抗病毒作用

目的: 探讨以肠病毒71(entrovirus 71, EV71) 2A蛋白酶(2Apro)基因为靶序列合成的siRNA是否具有潜在的抗病毒作用。方法: 用Lipofectamine 2000脂质体分别将40、60、80 nmol/L FITC标记的BLOCK iT Fluorescent Oligo转染RD细胞,通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率。将化学合成的3个siRNA 2Apro (siRNA 69、294、319)和阴性对照的乱序si RNA(siRNA SCS)转染RD细胞,siRNA 2Apro为实验组,siRNA SCS为阴性对照组,另设模拟转染组,仅用脂质体处理;用EV71分别感染各组RD细胞,观察细胞形态学改变,荧光定量PCR和蛋白质印迹检测病毒RNA和VP1蛋白。结果： 当siRNA浓度为60 nmol/L时转染效率最高,达87%。细胞形态学结果显示,与对照组比较,实验组细胞只发生了轻微的病变。荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,siRNA 2Apro组的病毒RNA和VP1蛋白明显低于对照组(P<0.01)。结论： 以EV71 2Apro基因为靶序列化学合成的siRNA能有效地抑制病毒的复制。     

shRNA抑制C-erbB-2基因表达对小鼠Lewis细胞凋亡的影响

目的:探讨shRNA抑制C-erbB-2基因表达对小鼠肺腺癌Lewis细胞凋亡的影响.方法:构建4个pGPU6/RFP/Neo-erbB-2质粒和pGPU6/RFP/Neo-shNC.应用Lipofectamine 2000转染pGPU6/RFP/Neo-shNC至小鼠肺腺癌Lewis细胞,应用荧光显微镜观察荧光,确定最佳转染效率.应用RT-PCR检测C-erbB-2 mRNA的水平,应用Western blotting检测该蛋白的表达,筛选干扰效果最好的质粒.应用流式细胞术检测空白组、pGPU6/RFP/Neo-shNC组和最佳干扰组细胞的凋亡率.结果:pGPU6/RFP/Neo-shNC(μg)∶Lipofectamine (μl)为0.4∶1时,转染效果最好.4个pGPU6/RFP/Neo-erbB-2质粒均能降低C-erbB-2 mRNA水平和蛋白的表达,其中干扰效果最好的是pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669,用于后续实验.pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669质粒组的凋亡率高于空白组和pGPU6/RFP/Neo-shNC组(P＜0.05).结论:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669质粒能抑制小鼠Lewis细胞C-erbB-2基因的表达,诱导细胞凋亡.     

病毒及非病毒载体对U937单核细胞的转染效果

目的：比较研究腺病毒、慢病毒和Lipofectamine 2000 3种方法转染U937细胞的效果差异,以寻找一种简便、高效转染U937细胞的方法。方法：分别采用Lipofectamine 2000介导质粒载体（pGPHI/GFP/Neo）,腺病毒（Adv-GFP-NC）和慢病毒（LV-GFP-NC）3种方法转染U937细胞,于脂质体转染48 h后、腺病毒和慢病毒转染96 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）表达情况,并收集细胞以流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。台盼蓝染色法计数不同转染方法对细胞活力的影响。结果：Lipofectamine 2000介导质粒载体转染组、腺病毒转染组GFP阳性细胞极少,流式细胞仪检测GFP阳性细胞均＜4%;慢病毒转染组GFP阳性细胞满视野,感染复数=100时,GFP阳性细胞约占90%。台盼蓝染色法显示腺病毒、慢病毒组活细胞率明显高于脂质体组,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：慢病毒不仅使Lipofectamine 2000和腺病毒能有效地将外源基因导入U937细胞内表达,也是转染U937细胞的理想载体。     

FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响

目的探讨转染试剂FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响,并寻找最佳的转染比例。方法采用转染试剂FuGNE6(以6μl为例)与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为6∶0.5,6∶1,6∶1.5,6∶2,6∶4,6∶6及GPC3-iRNA量固定1μg(以此为例),转染试剂与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为2∶1,4∶1,6∶1,8∶1,10∶1进行转染。分别用荧光显微镜、流式细胞仪及PI染色实验观察细胞转染效率及48h细胞存活率。结果FuGNE6固定为6μl时,质粒用量从0.5-2μg转化效率逐步增高,超过2μg后转染效率反而大大降低,各比例组在48h细胞存活率都在95%以上;质粒量固定为1μg时,随转染试剂增加转化效率不断增大,超过6∶1时,随转染试剂增加,48h细胞存活率也逐渐下降。结论FuGNE6与GPC3-iRNA比例为6∶1.5时转化效率最大,且细胞存活率高。     

完全胃肠外营养治疗的护理

目的：探索完全胃肠外营养治疗的护理。方法：通过复习献,综述国内外部份护理工作对完全胃肠外营养治疗的护理经验。结果：完全胃肠外营养治疗不当可给患带来不必要的损害,甚至危及患生命,产生原因主要来自操作技术及护不当。结论：为使TPN支持顺利进行,减少或避免并发症的发生,要求熟练掌握配制技术,做好导管护理,在输液过程中观察病人的反应,监测有关指标,掌握滴注速度等。     

针灸治疗抑郁症机理的研究

通过整理、分析、归纳近几年有关针灸治疗抑郁症机理方面的文献,提示针灸治疗抑郁症机理包括影响行为学、调节神经内分泌、保护受损的海马神经、通过调节细胞因子含量增强免疫功能、调整中枢神经递质的含量及增加受体结合位点等方面。然亦发现针灸治疗抑郁症的机理还存在许多不足,是亟待深入探索的问题。     

针灸对排尿功能调节作用的研究进展

人体的排尿是极为复杂的过程,正常控尿需膀胱、尿道功能完好及二者协调。以尿频、尿急、尿失禁等为主要症状的排尿障碍性疾病是临床常见病、多发病,严重影响患者生活质量。现代医学至今尚无排尿障碍的有效疗法。但国内外大量的临床资料表明,中医针灸对排尿功能有良好的调节作用,已成为研究热点。本文对近年来针灸调节排尿功能的临床观察及其作用机制等研究进展作一简要综述。     

妇科消炎片对大鼠输卵管炎性阻塞影响的实验研究

目的 探讨妇科消炎片治疗输卵管炎性阻塞的作用机理。方法 将15％苯酚糊剂注入大鼠输卵管内，建立输卵管炎性阻塞模型，观察妇科消炎片对输卵管炎性阻塞大鼠组织学和血液流变学的影响，并以妇炎康作对照。结果 治疗30d后，治疗组输卵管通畅率、积液率、炎症程度及血液流变学与模型组比较有非常显著性差异(P＜0．01)，其疗效与妇炎康相当。结论 妇科消炎片能改善微循环，抑制炎症，减少炎症渗出，促进受损组织修复，从而达到治疗输卵管炎性阻塞，改善恢复其生理功能的目的。     

升阳十一味丸对bax表达的相关研究

目的:探讨升阳十一味丸治疗肿瘤的分子机制。方法:用升阳十一味丸治疗肿瘤鼠,以免疫组化方法测定bax的表达情况。结果:与阴性对照组相比,治疗组bax表达上调,有显著性差异(P<0.05)。结论:该药有抑制肿瘤的作用。     

Noxa的促凋亡作用与肿瘤关系的研究进展

Noxa是Bcl-2家族中促凋亡的BH3-only亚家族成员之一,是p53的下游靶基因,其表达主要受p53调控。它定位于线粒体,其BH-3结构域主要与Mcl-1结合,启动caspase级联反应,诱导细胞凋亡。Noxa可以通过p53依赖途径及p53非依赖途径促进细胞凋亡,在肿瘤的形成和治疗中发挥着重要作用。     

情绪对决策影响的研究

情绪对决策行为产生深刻的影响,目前已经成为认知神经科学与心理生理学的热点研究领域。本文就情绪对决策的影响、情绪对决策影响的研究范式来进行阐述,文章最后展望了情绪对决策影响的发展前景。     

胰腺MR检查序列应用探讨

目的 分析97例胰腺MRI检查中不同序列图像,探讨胰腺MR扫描序列优化方案.方法 胰腺检查患者97例,其中,正常36例、囊肿2例、胰腺炎42例、胰腺肿瘤17例.平扫序列横轴位T2WIFSE、T2WI FS-FSE、T1WI SPGR In phase和Out of phase,TjWI FS-SPGR;冠状位FIESTA,T1WISPGR,动态增强检查序列为LAVA.重点分析胰腺疾病征象在各序列中的显示情况.结果 胰腺病变总显示率96.7％,其信号改变以T1WI FS-SPGR显示最优(91.8％);胰周、肾前筋膜改变T2WIFS-FSE序列显示率分别为70.5％、62.3％,二者均具有显著性优势P＜0.05;FIESTA对胰管及胰周改变显示率与T2WI FS-FSE相比没有显著性优势P＞0.05;MRCP胰管显示率100％,LAVA对各项观察指标显示率并不优于所有平扫序列,对肿瘤病变显示率为94.1％,高于胰腺炎显示率52.4％,但没有统计学意义(P＞0.05).结论 T1WI FS-SPGR序列,可作为胰腺MR平扫的基本序列,T2WI首选T2WI FS-FSE序列,二者结合能很好显示胰腺及周围病变,配合冠状位T1WI SPGR和3D MRCP,显示胰周脂肪结构及胰管情况,部分病变能初步定性,如怀疑胰腺肿瘤,LAVA序列必不可少,可确定病变范围及周围血管、腹膜后受累情况.     

音乐对父母陪伴下小儿麻醉诱导的影响

目的评价音乐对父母陪伴下小儿麻醉诱导的影响。方法以父母和小儿术前焦虑程度为首要研究目标,父母满意程度为次要研究目标。将100例ASAⅠ或Ⅱ级的择期手术患儿,年龄2～10岁,随机分成2组:音乐辅助组(音乐辅助父母陪伴)和对照组(单纯父母陪伴)。通过术前焦虑评分(mYPAS评分)测定两组小儿术前焦虑程度;通过状态-特质焦虑问卷(STAI)测定父母术前焦虑程度;通过视觉模拟评分(VAS)评价父母满意程度。结果音乐辅助组父母术前焦虑评分降低(P<0.05),满意评分略升高,但差异无统计学意义(P>0.05);音乐辅助组小儿焦虑评分较低,但是两组之间的差异无统计学意义。结论音乐辅助可以减轻父母在陪伴小儿麻醉诱导期间的焦虑心理,但对小儿的焦虑心理作用有限。