鹅细小病毒与番鸭细小病毒差异分析及鉴别诊断方法研究进展

鹅细小病毒和番鸭细小病毒在大小、形态、理化特性、核酸类型、基因组结构等方面非常相似,而且两种疫病的流行病学、临床症状、病理变化也非常相似;两者的抗体也有一定的交叉保护性,用常规的血清学检测方法很难将这两种病毒区分。本文对鹅细小病毒和番鸭细小病毒的基因组结构和病毒编码的蛋白进行了比较分析,概述了两种病毒在基因组结构和抗原性上存在的差异,以及已经建立的鉴别诊断方法。     

鹅细小病毒PCR诊断方法的初步建立

根据GeneBank上已发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计合成1对引物,以GPV阳性毒株鹅胚尿囊液及攻毒后死亡的雏鹅组织,提取DNA并进行PCR,结果产物扩增出的片段与预期片段440 bp大小相符,测定序列与GeneBank上GPV B株同源性达99%。试验结果显示用该方法可以特异性地诊断出GPV,比琼脂扩散试验(AGP)敏感性高,可检测最低浓度为102.5GELD50/0.2mL;检测攻毒后死亡的雏鹅组织,在脑、肝、肺、肾、肠等组织中均有GPV的存在,可以用于临床可疑病毒的分离鉴定。所建立的PCR方法具有高度的特异性、敏感性和可重复性。     

基于生物信息学预测的番鸭细小病毒和鹅细小病毒免疫交叉反应研究

通过生物信息学软件开展了基于表位预测的番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)免疫交叉反应研究.番鸭细小病毒非结构蛋白线性抗原表位预测结果表明:AA248～252、503～509和545～554可能是线性表位优势区域,与已知的鹅细小病毒非结构蛋白线性抗原表位区进行比较,可能具有交叉反应性的区段为AA503～509.番鸭细小病毒农壳蛋白线性抗原表位预测结果表明:肽段AA27～33、39～50、67～75、111～115、149～155、260～264、321～325、426～430、448～452、485～489、521～525、540～544和685～691等区域可能是线性表位优势区域,与已知的鹅细小病毒衣壳蛋白线性抗原表位区进行比较,可能具有交叉反应性的区段为AA321～325、426～430、540～544和685～691.     

番鸭细小病毒病与番鸭常见病的区别诊断

总结了番鸭细小病毒病与小鹅瘟、雏鸭肝炎、新鸭疫病、鸭瘟、鸭传染性浆膜炎、鸭巴氏杆菌病、鸭副伤寒以及鸭白肌病等番鸭常见病的区别,以供番鸭细小病毒病的鉴别诊断参考。     

鹅细小病毒于番鸭成纤维细胞上的适应性研究

为进一步了解鹅细小病毒（GPV）在番鸭成纤维细胞（MDEF）上的适应性及病毒增殖情况,将GPV在MDEF上连续传12代培养,通过PCR、免疫荧光、流式细胞等方法分析其生物学特性。PCR检测结果显示,扩增到大小为734bp的非结构蛋白基因片段,将10倍梯度稀释的病毒悬液接种细胞培养65h后,10-6倍接种的细胞仍能检测到病毒核酸。免疫荧光检测显示,兔抗GPV阳性血清能对染毒的病灶产生特异性荧光染色。流式细胞试验结果进一步证实,GPV在MDEF上增殖速度比较慢,病毒的感染会造成MDEF的早期凋亡。说明该GPV株感染MDEF后虽未产生细胞病变,但病毒能在MDEF中增殖,为GPV开展细胞依赖性相关研究奠定基础。     

鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中鹅细小病毒(GPV)的7株全基因序列,在相对保守的NS区域设计了一对引物,以GPV-98E株鹅胚尿囊液的核酸提取物为模板,经优化反应条件,建立了特异性检测GPV的PCR方法。敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4.194 pg,尿囊液的最小检出量为3.09个ELD50;特异性试验结果显示,采用该方法检测GPV能够扩增出与预期大小相符的476 bp的特异性片段,而对作为对照的鸭瘟病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)、鹅副粘病毒(GPMV)的核酸均未扩增出任何条带。在临床检测中,对52份雏鹅的心、肝、肠等组织进行PCR扩增,能够检测到相应的特异性病毒核酸片段,表明建立的鹅细小病毒PCR检测方法具有敏感性高、特异性强的特点,具有潜在的临床应用价值。     

番鸭细小病毒特性的初步研究

将纯化的番鸭细小病毒（ＭＰＶ）在电镜下观察，呈球形或六角形，无囊膜，正二十面体对称，大小为２４～２５ｎｍ壳粒呈中空管状，直径约３～４ｎｍ，壳粒数为３２。病毒无血凝性，对氯仿，乙醚、胰酶、酸和热不敏感，对紫外线敏感。ＭＰＶ在氯化铯中沉淀时具有３条区带，其密度分别为１．２８～１．３０，１．３２，１．４２ｇ／ｃｍ＾３，其中第３条矍有感染性。病毒具有４种结构多肽：ＶＰ１（８９ｋｄ），ＶＰ２（６８ｋｄ），Ｖ     

鹅细小病毒vp3基因PCR检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank上发表的鹅细小病毒B株基因序列,针对vp3基因设计并合成了一对特异性引物,建立GPV vp3基因的PCR诊断方法。结果表明,该方法扩增的产物与预期大小相符(约654bp),而其他相关病毒均为阴性反应,敏感度为12.4pg。对15份GPV疑似病例检出的阳性率为100%,而琼脂扩散试验(AGP)检出的阳性率为60%。证明建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于临床病料的快速诊断。     

基于PCR技术的番鸭细小病毒和沙门氏菌混合感染诊断

2010年9月贵州省某养鸭场送检病鸭5例,为确诊病因,同时为其及时防治提供科学依据,对病例进行了流行病学调查、实验室剖检病变观察、细菌学、PCR检测。结果表明:该病例为番鸭细小病毒和沙门氏菌混合感染,分离的沙门氏菌具有高致病性,仅对氧氟沙星敏感,对多种常用药物产生耐药。     

番鸭细小病毒弱毒疫苗的研究

应用生物技术从番鸭细小病毒菁田株（ＭｕｓｏｖｙＤｕｌｋｉｌｉｎｇＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＭＰＶ－Ｐ）选育出对１日龄雏番鸭无致病力的弱毒疫苗株（ＭＰＶ－Ｐ１）。该弱毒株具有良好的兔原性和遗传稳定性；制备成疫苗，免疫注射１日龄雏番鸭，免疫后３ｄ部分鸭血清中出现抗体，７ｄ９８％以上的鸭血清中出现抗体；２１－３０ｄ抗体效价达高峰，有效免疫期在１９０ｄ以上；注苗后７ｄ攻毒，保护率１００％；当ＬＰＡＩ滴度在ｌｏ     

应用PCR方法检测鹅细小病毒感染

根据GenBank中发表的GPVB株全基因序列,应用生物学软件Primer5.0设计了针对鹅细小病毒VP3(574bp)的特异性引物,建立了小鹅瘟PCR诊断方法。对鹅细小病毒疫苗株和临床病料样品进行了PCR检测,结果从疫苗株和临床病料样品(7/9)中扩增到与预计大小一致的目的片段,而对照的鹅副粘病毒、新城疫病毒和鸭瘟病毒PCR结果均为阴性,敏感性检测结果表明,该PCR可以检测到0.124ng/L的GPV的核酸模板,因此,所建立的PCR方法特异性强,可用于临床病料的快速诊断。来源于黑龙江不同地区的送检样品检测结果表明,小鹅瘟分布广泛,仍是危害雏鹅的重要病毒性传染病。     

抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次,收集鸡蛋,并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定,用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32,能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性,对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DNA模板检出量为15 pg/mL。对鸭瘟的临床病料检测证明,该方法具有特异、快速和敏感的特点,可有效鉴别DPV。