鸢尾糖基转移酶ItUGT797基因的克隆与表达分析＊

目的 对川射干（Iris tectorum Maxim.）中可能参与黄酮类化合物生物合成的糖基转移酶基因ItUGT797展开初步研究，解析ItUGT797编码蛋白的各项生物信息指标并优化其原核表达体系。方法 提取鸢尾各组织部位的RNA并进行反转录获得cDNA文库，根据鸢尾转录组中ItUGT797基因序列设计基因特异性引物，通过同源克隆的方法构建pET-32a （+）-ItUGT797原核表达重组载体。使用各类生物信息学网站对测序后的ItUGT797序列进行理化性质、蛋白结构和进化关系等分析；实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证基因在各部位的表达情况；蛋白体外表达情况则使用大肠杆菌体系检测。结果 ItUGT797开放阅读框长度为1455 bp，编码蛋白分子量大小分别为53.80 kDa。ItUGT797在各组织中表达情况为花>叶>根茎。系统发育进化树表明，ItUGT797可能是具有7-O-糖基化活性的糖基转移酶。原核表达结果显示在诱导剂IPTG为0.1mM时，ItUGT797能够表达出较多的可溶性蛋白。结论 本研究成功从鸢尾中克隆了ItUGT797基因，并分析了其编码蛋白的特征，检测了基因在根茎、叶和花中的表达量，同时通过原核表达体系筛选出最适合该基因可溶性蛋白表达的诱导剂浓度，为后续探索其参与鸢尾中黄酮类成分生物合成的功能奠定理论基础。     

黄连WRKY基因家族鉴定及表达分析＊

目的 本研究使用生物信息学方法鉴定黄连WRKY基因家族成员并对其表达模式进行分析，为进一步研究黄连WRKY基因家族的功能及其对黄连生物碱合成途径的调控机制提供参考。方法 利用HMMER、BLAST、TBtools、IQ-Tree等软件，ExPASy、WOLF PSORT、MEME在线网站等对黄连基因组中的WRKY基因家族进行鉴定、可视化分析和表达模式分析。结果 从黄连基因组中鉴定出了41个WRKY基因，其ORF长度为252-2796 bp，编码蛋白的氨基酸数量为84-931 aa，分子质量为9649.32-103620.60 Da，等电点为4.96-10.17，95%以上蛋白预测亚细胞定位于细胞核；41个CcWRKY（黄连WRKY）基因不均一地分布在9条染色体上；系统发育分析将41个CcWRKY蛋白分为3大类，第Ⅰ类有6个，第Ⅱ类有31个，第Ⅲ类有4个；同一类CcWRKY蛋白结构域高度保守，大多CcWRKY基因外显子数量为3-7，内含子数量为2-6。表达分析结果为，除了保守结构域高度缺失的CcWRKY38、CcWRKY40外，所有的CcWRKY都至少在一个组织中有表达，且多数是特异性表达。结论 全面分析了黄连基因组中的WRKY基因家族，有助于进一步解析WRKY基因家族在黄连生物碱生物合成途径的调控机制。     

黄连NRAMP3基因的克隆与生物信息学分析＊

目的 克隆黄连（Coptis chinensis Franch.）中自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein，NRAMP）的编码基因，并进行生物信息学分析。方法 从黄连基因组中比对NRAMP3基因，并根据比对的基因序列设计特异性引物，经PCR扩增得到的黄连NRAMP3编码序列，进行克隆、测序和生物信息学分析，并利用qPCR技术对黄连NRAMP3基因进行时空表达分析。结果 得到黄连NRAMP3基因cDNA序列，全长1617 bp，编码538个氨基酸，通过与GenBank上的其他蛋白序列比对，将其命名为CcNRAMP3；序列分析显示，黄连NRAMP3基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域（PF01566），有12个跨膜结构域，亚细胞定位于液泡膜上，具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分；三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体（MntH）的晶体结构。利用系统进化关系分析推测它可能具有转运重金属元素Cd功能。对黄连NRAMP3基因的组织表达分析表明，CcNRAMP3基因在黄连叶片中表达量最高。在遭受镉胁迫时，在须根中表达量先升高后降低，该基因很可能主要在根部对镉进行响应并发挥作用。结论 本研究首次通过克隆得到黄连NRAMP3基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，这些结果将为黄连NRAMP3基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据和基因资源。     

药用植物珊瑚菜GlAT基因的克隆和生物信息学分析

目的:对药用植物珊瑚菜Glehnia littoralis BAHD酰基转移酶(Acyltransferase,AT)基因序列进行生物信息学分析。方法:用茉莉酸甲酯(MeJA)处理珊瑚菜幼苗,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlAT候选基因的表达量,在已建立的珊瑚菜转录组数据中筛选出表达量较高且MeJA处理后上调表达的1条GlAT基因序列,对该基因cDNA序列进行全长克隆;根据所得的氨基酸序列进行蛋白质理化性质、二级结构、三级结构分析,利用MEGA 6.0构建该蛋白序列的NJ系统进化树。结果:GlAT的全长开放阅读框ORF(Open Reading Frame)为1443 bp,编码480个氨基酸。该蛋白相对分子质量为52844.14,等电点为6.92,为亲水性蛋白,属于转移酶超家族。珊瑚菜GlAT蛋白与同科植物胡萝卜Daucus carota subsp.sativus的AT蛋白亲缘关系最近。结论:首次获得珊瑚菜GlAT基因的ORF全长序列并进行了生物信息学分析,为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。     

巴瑞特食管差异表达基因及中药预测的生物信息学分析＊

目的 本研究通过生物信息学技术分析Barrett食管（BE）患者与健康对照的基因芯片数据，筛选BE的差异表达基因，探寻BE的发病机制及生物标记物，预测BE治疗的潜在中药。方法 从基因表达数据库（GEO）提取GSE34619，GSE13083，GSE1420，GSE13898，GSE26886基因芯片原始数据，使用GEO2R筛选差异表达基因（DEGs）。利用DAVID数据库对DEGs进行功能和信号通路的富集分析，String数据库构建蛋白互作网络，Cytoscape软件及其插件筛选核心基因，并在TCGA数据库中检测核心基因的表达。使用Kaplan Meier-plotter算法分析关键基因对食管腺癌患者整体生存率的影响。将核心基因与中药预测工具相互映射，筛选治疗BE可能的靶向中药。结果 筛选出下调DEGs109个，上调DEGs24个。上调DEGs的KEGG通路主要富集在自噬和mTOR信号通路，下调DEGs主要富集在胰腺分泌，胃酸分泌，胆汁分泌，酪胺酸代谢等通路。RRAGD，APP，KRT20，EPCAM，CFTR和AGR2筛选为关键基因。AGR2和EPCAM的异常表达与食管腺癌患者整体生存率有关。筛选治疗BE的潜在中药有三七、丹参、牛膝、姜黄、人参、白果、黄芪、甘草等。结论 RRAGD，APP，KRT20，EPCAM，CFTR和AGR2可能与BE发生发展相关，APP、EPCAM、CFTR、ACR2可作为BE患者风险分级指标。以丹参、三七为代表的活血祛瘀药和以人参、黄芪为代表的补气药可能为BE治疗的潜在靶向中药。本研究将差异基因表达与中药治疗靶点相结合，以期阐明BE的发病机制，寻找BE高危预警标记物，为中药新药研发提供了理论依据和技术支持，为BE诊断治疗的中西医结合之路做出了初步探索。     

珊瑚菜GlPS1、GlPS2基因克隆及表达分析

目的克隆珊瑚菜Glehnia littoralis补骨脂素合成酶(psoralen synthase,PS)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学和表达量分析。方法在前期珊瑚菜转录组测序的基础上,筛选出表达量较高的2条PS基因GlPS1和GlPS2序列。利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法对2个基因cDNA序列3’端进行克隆,DNAMAN拼接后得到基因全长cDNA序列,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlPS1和GlPS2基因的组织特异性表达。结果 GlPS1和GlPS2基因cDNA序列全长分别为1 885 bp和1 971 bp,编码495和502个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为55 740.7和56 363.9,等电点为8.28和6.62,均属于细胞色素P450超家族,含有1个跨膜区,为亲水性蛋白。系统进化分析表明,GlPS1和GlPS2与伞形科欧防风Pastinaca sativa、旱芹Apium graveolens、大阿米芹Ammi majus PS蛋白亲缘关系较近。RT-qPCR结果显示GlPS1基因在根中表达量较高,在叶中表达量较低,而GlPS2基因在花中表达量较高,在根中表达量较低。结论首次获得珊瑚菜GlPS1和GlPS2基因的全长cDNA序列并进行了表达分析,为进一步开展珊瑚菜补骨脂素合成酶基因的功能和遗传调控机制研究奠定基础。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

黄连NRAMP5基因的克隆与生物信息学分析＊

目的 获得并分析黄连（Coptis chinensis Franch.）中自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein，NRAMP）的编码基因。方法 根据黄连基因组测序结果中的NRAMP基因序列设计特异性引物，经PCR扩增得到黄连NRAMP5编码序列，进行TA克隆、测序及生物信息学分析。结果 得到黄连NRAMP5 cDNA序列，全长1611bp，编码536个氨基酸，通过与Genbank上的其他蛋白序列比对，将其命名为CcNRAMP5；序列分析表明黄连NRAMP5基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域（PF01566），是一种拥有11个跨膜结构域，亚细胞定位于质膜处的膜蛋白，具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分；三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体（MntH）的晶体结构。通过系统进化关系分析推测其可能具有二价金属离子转运功能。结论 首次通过克隆得到黄连NRAMP5基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，这些结果将为黄连NRAMP5基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据。     

温郁金萜类合成酶基因CwTPS05、CwTPS10的克隆与表达分析

目的克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类合成酶基因(CwTPS05 CwTPS10)并进行生物信息学及表达分析,为今后利用代谢工程生产温郁金萜类成分提供依据。方法根据前期温郁金转录组测序数据,利用PCR技术从根茎cDNA文库中克隆CwTPS05和CwTPS10序列;生物信息学分析其核苷酸和氨基酸序列特征;qRT-PCR检测基因在不同组织中的表达水平。结果克隆获得CwTPS05 (GenBank登入号:MT814867)基因,开放阅读框全长1446 bp,编码481个氨基酸,预测相对分子质量为55 990;CwTPS10 (GenBank登入号:MT814863)基因,开放阅读框全长1494 bp,编码497个氨基酸,预测相对分子质量为58 550。CwTPS05和CwTPS10均属于酸性、非跨膜、无转运肽的亲水性蛋白。同源进化树分析表明,CwTPS05和CwTPS10基因被归类为植物萜类合成酶TPSa亚家族。qRT-PCR分析表明,CwTPS05在根茎中特异性表达,CwTPS10在根茎和块根中特异性表达。结论成功克隆获得温郁金CwTPS05和CwTPS10基因并进行生物信息分...     

磷钾肥配施对北沙参香豆素成分含量及产量的影响

采用正交试验研究不同配比的磷钾肥对北沙参中欧前胡素、异欧前胡素和补骨脂素的含量及产量的影响。结果显示:一定范围内配合施用磷钾肥北沙参根干重、小区产量增加,且磷肥对产量影响大于钾肥,当肥料施用量为P₂O₅ 360 kg·hm^-2,K₂O 270 kg·hm^-2和P₂O₅ 360 kg·hm^-2,K₂O 180 kg·hm^-2时北沙参根干重达到最优值,小区产量最大。磷钾肥对北沙参中欧前胡素、异欧前胡素含量的影响表现为随磷、钾肥的增施而升高,且磷肥影响较大,当施用P₂O₅ 360 kg·hm^-2,K₂O 270 kg·hm^-2时异欧前胡素含量最高,欧前胡素量和补骨脂素含量均较高;施用P₂O₅ 360 kg·hm^-2,K₂O 180 kg·hm^-2时欧前胡素量最大,异欧前胡素量也较大。因此,当磷钾肥的施用量分别为P₂O₅ 360 kg·hm^-2,K₂O 180 kg·hm^-2时,成本低,优质高产,适于推广至农业生产实践中。     

北沙参内生真菌的抑菌活性与分类研究

目的研究北沙参内生真菌的抗菌活性,鉴定活性真菌的分类地位。方法采用植物组织分离法从北沙参基原植物珊瑚菜Glehnia littoralis中分离内生真菌。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色假丝酵母为指示菌株,采用牛津杯法研究北沙参内生真菌的抑菌活性,对具有抑菌活性的内生真菌进行分子鉴定。结果有4株内生真菌对大肠杆菌具有抑制作用,内生真菌发酵浓缩液抑菌圈直径与4 U/mL硫酸庆大霉素抑菌圈直径的比值(d/D)最大可达1.07;有15株内生真菌对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,d/D值最大为0.65;有3株内生真菌对白色假丝酵母具有抑制作用,内生真菌发酵浓缩液与0.2 mg/mL氟康唑的d/D值最大可达1.27。19株具有抑菌活性的内生真菌归于4个目,5个科,7个属,8个种。结论北沙参植物中存在多种抑菌活性的内生真菌,对于北沙参内生真菌资源的开发及药材道地性的评价具有一定的指导意义。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

人参NAC基因家族成员的鉴定与表达分析＊

NAC基因是一类植物中特有的转录因子家族，广泛参与植物生长发育、信号转导及逆境胁迫下的调节过程。本研究鉴定出人参NAC基因家族共有197个成员。将拟南芥NAC基因与鉴定出的人参NAC基因共同构建系统发育树，可将其分为15个亚族。根据转录组分析结果，PgNAC020、PgNAC021、PgNAC022、PgNAC023在花中呈现高表达现象，可能参与花的生长发育；PgNAC075、PgNAC076在果实中高表达，可能参与人参果实成熟过程；PgNAC092、PgNAC093、PgNAC094、PgNAC095可能参与人参花的形态建成，也可能参与植物的抗寒过程。本研究为人参NAC家族基因功能研究，以及NAC调控人参的生长发育提供理论参考。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。