嗜吞噬细胞无形体的致病机制的研究进展

嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,APH)是重要人兽共患病——人粒细胞无形体病(HGA)的病原体.APH专性侵染哺乳动物中性粒细胞,入侵后在细胞内形成包涵体逃逸溶酶体酶的杀伤,APH同时破坏宿主细胞的凋亡和自噬,并抑制宿主细胞的氧化反应等杀菌活性.APH通过一系列毒力分子表达影响宿主细胞,使其在宿主细胞内有效生存和繁殖,最终导致机体感染的发生.     

浙江磐安地区啮齿动物嗜吞噬细胞无形体感染研究

目的 调查浙江省磐安地区啮齿动物无形体属嗜吞噬细胞无形体的自然感染状况,了解其分子生物学特性。方法 在浙江省磐安地区低山田地里捕获多种啮齿动物230只(黄胸鼠、社鼠、褐家鼠、小林姬鼠、黄毛鼠、青毛鼠、大林姬鼠、白腹巨鼠、针毛鼠、黑线姬鼠和松鼠);解剖取肝脾;提取DNA,用巢式PCR扩增无形体属16S rRNA片段;PCR产物测序,并进行Blast 同源性比较,最后采用MEGA4.0软件与GenBank登录的其它无形体属种株进行系统发生分析。结果 230只啮齿动物中,1只黄胸鼠、1只褐家鼠和2只白腹巨鼠肝脾标本检出无形体属16S rRNA片段,磐安地区野鼠无形体属立克次体的自然感染率为1.7%。3份阳性标本PCR产物测序,序列比对分析表明,从褐家鼠同时检出分别与嗜吞噬细胞无形体和浙江无形体株ZJ05/2009完全一致的序列,黄胸鼠和1只白腹巨鼠的序列与浙江无形体株ZJ05/2009完全一致。结论 浙江省磐安地区野鼠检出致病性无形体属核酸,存在无形体属不同种株的复合感染感染。提示可能存在无形体病自然疫源地,需要进一步密切关注致病性无形体的人群感染情况。     

湖北省随州市羊携带嗜吞噬细胞无形体的调查

目的调查湖北省随州市羊携带嗜吞噬细胞无形体的状况。方法运用聚合酶链反应方法对湖北随州市采集的羊血标本进行嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因片段进行扩增和序列分析,将扩增序列与GenBank相应基因序列进行同源性比较和进化分析。结果共检测羊血标本29份,阳性标本25份,嗜吞噬细胞无形体阳性感染率为86．2％;所检出的嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因（1442bp）与GenBank中收录的部分嗜吞噬细胞无形体16srRNA基因序列的同源性高达97．1％～99．8％,进化分析显示与嗜吞噬细胞无形体同在一个分支上。结论湖北随州地区山羊存在嗜吞噬细胞无形体的感染。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

嗜吞噬细胞无形体表面蛋白P44研究进展

P44是嗜吞噬细胞无形体p44/msp2基因家族编码的膜表面含量最多、研究最广泛的蛋白。其作为一个穿孔蛋白广泛参与病原体感染早期的黏附、入侵、免疫逃逸及新陈代谢等多种复杂生理活动,与嗜吞噬细胞无形体的致病机制密切相关,已成为当下研究的热点分子。本文就该蛋白分子的主要生理功能、分子生物学特性等方面对其进行全面阐述。     

北京东北部山区人群嗜吞噬细胞无形体血清流行病学调查

目的 了解北京东北部山区人群嗜吞噬细胞无形体的感染状况,为制定相应的防控策略提供依据。方法 在北京密云与怀柔区采集人群血清,采用间接免疫荧光法检测嗜吞噬细胞无形体IgG抗体,进行血清流行病学调查。结果 801份血清中嗜吞噬细胞无形体IgG抗体阳性者106份,阳性率13.23%,其中密云区为13.48%,怀柔区为12.70%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 北京密云与怀柔区正常人群中均有嗜吞噬细胞无形体感染的存在,应加强人粒细胞无形体病的监测和防控工作。     

湖北省长角血蜱携带嗜吞噬细胞无形体的调查

目的调查湖北省长角血蜱是否携带嗜吞噬细胞无形体。方法运用聚合酶链反应方法对湖北随州地区采集的蜱标本进行嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因片段进行扩增和序列分析,将扩增序列与GenBank注册的基因序列进行比较。结果共检测游离蜱72只,蜱种鉴定均为长角血蜱,嗜吞噬细胞无形体最小感染率为4.22%;所检出的嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因与我国已在GenBank注册的24个相对应序列同源性100%。结论湖北省长角血蜱携带嗜吞噬细胞无形体。     

云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染调查

目的 了解云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体自然感染情况。方法 应用单纯随机抽样法,从665份野外鼠形动物肝脾标本中抽取407份,采用巢式PCR对样本进行嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因检测,并对扩增产物测序,应用生物软件MEGA7.0将所测序列与GenBank注册的其它无形体属种株进行序列对比分析。结果 检测野外鼠形动物3目5科12属17种407只,阳性率为3.19%(13/407),其中大足鼠、黄胸鼠和斯氏家鼠阳性率分别为21.43%(3/14)、6.00%(6/100)和4.94%(4/81),其它鼠形动物均未检测出阳性;不同海拔梯度(P=0.219)、不同性别(χ²=0.441,P=0.506)及不同生境间(χ²=0.386,P=0.534)鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率差异无统计学意义;不同季节野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率差异具有统计学意义(P=0.044);序列对比分析显示所有样本基因序列与GenBank中收录的国内外部分嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因序列同源性达100%,进化分析显示与国内外部分嗜吞噬细胞无形体处同一个分支。结论 云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物存在嗜吞噬细胞无形体低度感染。     

甘肃、湖南和广东三省蜱体内嗜吞噬细胞无形体与伯氏疏螺旋体共感染研究

目的 嗜吞噬细胞无形体和伯氏疏螺旋体是由媒介蜱传播的引起人粒细胞无形体病和莱姆病的病原。目前,对两种病原在蜱体内共感染流行情况的研究相对较少。方法 以甘肃、湖南和广东三个省采集到3个蜱种、共543份样品为研究对象,检测嗜吞噬细胞无形体和伯氏疏螺旋体在蜱体内的感染情况。结果 嗜吞噬细胞无形体和伯氏疏螺旋体在不同地区采集到的蜱体内的感染率不同,分别为3.2%~20.0%和2.3%~19.3%。在检测的样品中,共发现有7份样品中同时感染嗜吞噬细胞无形体和伯氏疏螺旋体。青海血蜱、血红扇头蜱和微小牛蜱中均检测到这两种病原。结论 青海血蜱、血红扇头蜱和微小牛蜱均能够携带嗜吞噬细胞无形体和伯氏疏螺旋体,可能为这两种病原在自然界的持续存在和循环提供了条件。此研究结果丰富了人粒细胞无形体病和莱姆病的流行病学信息,有利于提高这两种病的防控策略。     

人嗜粒细胞无形体病合并噬血细胞综合征一例

本研究报道1例人嗜粒细胞无形体病合并噬血细胞综合征患者,以发热为首发症状,伴有血小板减少,多发淋巴结肿大和血清铁蛋白异常增高等表现,最终经嗜吞噬细胞无形体核酸、抗体检测,骨髓穿刺涂片等检查确诊,予以口服多西环素,治疗后患者病情缓解。     

猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究

目的通过对猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的表达,对其免疫性进行初步研究。方法利用生物信息学从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出谷胱甘肽转移酶(GST)基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),经过双酶切、PCR鉴定后,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析,Western blotting鉴定该蛋白免疫反应性。结果成功构建了重组体,并得到高纯度蛋白,该蛋白可被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫谷胱甘肽转移酶可在原核系统中获得具有免疫反应性的高效表达。     

十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7的原核表达、纯化及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7并鉴定抗凝活性。方法运用RT-PCR扩增十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7成熟蛋白及其组成肽段AduNAP7A、AduNAP7B的编码序列;将编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a及pICET32,构建重组表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用镍亲和层析一步纯化融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白;先后用几丁质亲和层析及镍亲和层析两个步骤纯化自切割后带6×his-tag的目的蛋白;用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测纯化表达产物的体外抗凝活性。结果获得AduNAP7、AduNAP7A及AduNAP7B的编码序列并成功构建了原核表达重组质粒;AduNAP7、AduNAP7A及Adu-NAP7B均在大肠中得到了高效可溶表达,纯化产物具有一定抗凝活性,它们延长aPTT比延长PT更有效。AduNAP7B的抗凝活性显著强于AduNAP7及AduNAP7A。结论AduNAP7具有较强抗凝活性,但显著弱于AcAP5、AcaNAP7及AcAPc2。AduNAP7的抗凝效应可能利于钩虫在人体内的吸血寄生生活,其抗凝作用机制有待进一步研究。     

细粒棘球绦虫重组CTxB-Eg95(TP)融合蛋白的原核表达

目的构建CTxB-Eg95(TP)融合基因原核表达载体,并诱导表达CTxB-Eg95(TP)融合蛋白。方法采用PCR技术分别克隆CTxB基因和141bp的Eg95基因片段序列Eg95(TP)并鉴定。分别将两个基因片段定向克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,构建pET-CTxB-Eg95(TP)重组质粒。将鉴定为阳性的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果测序结果表明已成功构建CTxB-Eg95(TP)融合基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示,转染pET-CTxB-Eg95(TP)的E.coliBL21(DE3)菌经IPTG诱导可表达大小约23.5kDa的特异蛋白条带,与预期结果一致。结论CTxB-Eg95(TP)融合基因获得了高水平的表达,为Eg95的表位研究和应用于口服疫苗奠定了基础。     

猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273的原核表达及纯化

目的 原核表达猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273。方法 通过PCR方法检测该基因在不同血清型猪链球菌中的分布情况,然后利用获得的猪链球菌2型05SSU0273基因片段, 构建重组表达载体pET32a::05SSU0273。将质粒转入E. coli BL21中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot实验证实目的基因的表达, 然后以His亲和层析柱纯化重组蛋白。结果 在S. suis 2 35个血清型标准株中,有20株分离株扩增出目的条带。重组质粒可在宿主菌中高效表达,经镍柱亲和层析得到相对分子质量为43 kD的重组蛋白。结论 本实验成功获得S. suis 2 MCP蛋白,为研究其在猪链球菌2型致病过程中发挥的作用奠定了基础。     

肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,转化Transetta（DE3）菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化

目的表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性。方法用1mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性。结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单位为15ku,与预期大小相符。ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应。结论成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础。     

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定

目的通过构建原核表达载体,获得阴道毛滴虫黏附蛋白65基因重组融合蛋白。方法分离并纯化培养阴道毛滴虫临床分离株,提取其总RNA,经RT-PCR扩其全长序列基因,T-A克隆测序后,连接表达载体PET-28a(+)。在E.coli(DE3)Plyss宿主菌中用不同浓度IPTG诱导目的蛋白的表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯AP65,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗阴道毛滴虫全虫多抗鉴定其免疫反应性。结果克隆ap65基因与GenBank公布基因同源性高,在1mmol/LIPTG诱导下,AP65产量可占细菌总蛋白量的23%,提纯后蛋白纯度达到90%以上,且重组蛋白AP65能与兔抗阴道毛滴虫全虫抗体发生特异性结合。结论成功地构建了阴道毛滴虫ap65基因的原核表达系统,重组蛋白且有良好的免疫反应性,可为疫苗抗原的筛选及单克隆抗体的制备奠定基础。