sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

抗菌抗癌肽CM4N在大肠杆菌中的融合表达与活性鉴定

为探讨内含肽intein在抗菌肽表达与纯化中的应用,采用递归PCR法合成CM4末端添加Asn的基因CM4N,克隆至E.coli表达载体pTYB11中,构建了与intein的C端融合的表达载体pTYYB11-CM4N.重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,融合蛋白intein-CM4N主要以可溶形式存在于胞内.利用载体中intein中的chitin结合域,将融合蛋白通过chitin亲和层析一步纯化,经DTT诱导intein的自我切割活性,实现CM4N在亲和柱上的切割与分离,透析冻干后得到了纯度95%以上的重组CM4N.活性检测结果显示,重组CM4N具有抗大肠杆菌、沙门氏菌和K562肿瘤细胞的活性.研究认为,内含肽在抗菌肽的基因工程中可能具有重要的应用前景.     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

大肠杆菌碱性磷酸酶在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达

目的 构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础.方法 以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力.结果 经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90％以上,酶比活力可达358.6 U/mg.结论 成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础.     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化

目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用IPTG诱导表达,并用亲和色谱纯化COMT。结果经测序分析成功构建了融合表达质粒Pet22b+-COMT。COMT基因在E.coli BL21(DE3)中表达相对分子质量约为28000的蛋白质,纯化后,COMT蛋白的纯度大于90%。结论COMT基因在原核中得到良好的表达,得到了纯度较高的蛋白质,为酶学活性研究奠定了基础。     

脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。     

融合头的改变对抑制重组抗菌肽毒性的影响

为进一步完善G13结构域的原核表达系统,人工合成编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pET28a中,构建的重组质粒pET28a-G13转化于E.coli BL21(DE3)中.另外对pET28a-G13进行突变,改变其G13片段N端上游处的融合头的电荷数,转化于E.coli BL21(DE3)中.构建pThiohisA突变体并与pET28a-G13共转化于E.coli BL21(DE3)中.用诱导剂诱导所构建的各个工程菌,然后比较A_(600)值变化及蛋白表达量,分析不同的融合头对G13毒性抑制效果,发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及酸性氨基酸的相对位置有关.     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

rAcAP5的溶栓作用及作用机制研究(英文)

犬钩虫抗凝肽（Ancylostoma caninum anticoagulant peptide,AcAP5）是一种已报道的FXa抑制剂,它对防止血栓溶解的TAFIa具有很强的抑制作用,本文进一步研究rAcAP5的纤溶活性和溶栓活性。采用发色产物法测定rAcAP5对TAFIa的抑制作用,用比浊法测定rAcAP5对尿激酶（UK）诱导的纤维蛋白溶解时间的影响,通过血栓称重法进行体外溶栓实验和体内动静脉旁路溶栓实验。采用常规方法测定正常大鼠优球蛋白溶解时间（ELT）,血浆纤维蛋白原含量和纤维蛋白降解产物（FDP）含量。rAcAP5浓度依赖地抑制TAFIa活性,其IC₅₀为63.7 nmol/L,为一个强的TAFIa抑制剂。rAcAP5（5-40 nmol/L）能够显著地加速尿激酶诱导纤维蛋白的溶解,缩短纤溶时间。rAcAP5能够提高尿激酶诱导的血栓减重（P<0.05）,单独使用rAcAP5也能显著增加体外实验的血栓减重（P<0.05）。在大鼠体内的动静脉旁路模型中,单次静脉给予rAcAP5（50-200μg/kg）能够剂量依赖地增加血栓减重（P<0.01）。rAcAP5在有效剂量对正常大鼠的ELT、血浆纤维蛋白原含量和FDP含量均无明显影响。研究结果提示:rAcAP5是一个强效溶栓多肽,它可能通过抑制TAFIa的活性而在血栓表面具有溶栓活性,而不影响循环血液中的纤溶活性和纤维蛋白原含量。     

免疫增强剂B淋巴细胞刺激因子的研制

目的克隆人B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)胞外区 12 8 2 85氨基酸cDNA ,并行高效表达、纯化及功能鉴定。方法提取HL 6 0细胞总RNA ,经RT PCR扩增编码人BLyS胞外区 12 8 2 85氨基酸的cDNA ,行序列测定后 ,构建于高效原核表达载体pQE 80L ,经IPTG诱导表达 ,Ni NTA色谱纯化 ,进而行免疫学活性检测。结果RT PCR扩增得到了 4 77bp的DNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码BLyS 12 8 2 85的cDNA序列一致 ,并在大肠杆菌中获得了高效表达 ,Ni NTA色谱纯化后 ,活性检测发现它能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖。结论成功克隆了人BLyS胞外区cDNA ,并获得了高效表达及纯化 ,纯化产物具有生物学活性     

Antithrombotic effects of YM466, a synthesized direct inhibitor of factor Xa,in an arterio‐venous shunt thrombosis model in squirrel monkeys

The antithrombotic effects of YM466, a synthetic direct inhibitor of human factor Xa (FXa), were evaluated in an arterio‐venous shunt thrombosis model in squirrel monkeys. YM466 significantly inhibited thrombus formation after continuous IV zx infusion at doses of 3–30 µg/kg/h. Although prothrombin time (PT) was significantly prolonged at doses of 10 and 30 µg/kg/h, this effect was small (1.2‐ and 1.4‐fold of the control, respectively). Furthermore, YM466 had no effect on template bleeding time and activated partial thromboplastin time at any dose. Plasma anti‐FXa activity increased in a dose‐dependent manner correlating with the antithrombotic effect of YM466. Thrombin‐antithrombin III complex levels decreased to less than normal levels at 30 µg/kg/h of YM466. Mean plasma concentrations of YM466 measured by LC/MS/MS were 2.5, 10.5, 27.4, and 75.5 ng/ml at doses of 1, 3, 10, and 30 µg/kg/h, respectively. These results suggest that YM466 is a safe antithrombotic agent with low bleeding risk, and that plasma anti‐FXa activity may be a suitable parameter for monitoring its antithrombotic effect. Drug Dev. Res. 58:190–195, 2003. © 2003 Wiley‐Liss, Inc.     

胸腺素α1—硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1)作为一种免疫增强剂,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因,克隆于pUC19的EcoRi和PstI位点,经测序证明序列正确后,串联为4串体（Tα1（4））,经再次确认后克隆入pThioHisA的EcoRI t PstI位点,转化大肠杆菌TOP10菌种,酶切鉴定证明正确后,经1mmol/L IPTG诱导4h,获得硫氧还蛋白与Tα1（4）的融合表达,并经Western blot分析证实,用离子交换柱层可纯化出硫氧还蛋白与Tα1（4）融合蛋白,利用3H－TdR掺入法证实,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。α     

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。     

NDRG4基因的克隆、表达及抑瘤活性研究

目的克隆、表达抑癌基因NDRG4,纯化后考察其抑瘤活性。方法将NDRG4基因克隆进PQE30/M15表达载体,诱导表达后亲和色谱纯化,对纯化表达产物进行一系列检测,考察其抑瘤作用。结果表达产物NDRG4蛋白相对分子质量为38 856,表达量为19.58%,纯度为92%,等电点为6.2,流式细胞术证实该蛋白质对HHCC和7901肿瘤细胞均阻滞在G1期,细胞实验和裸鼠致瘤抑制实验证实该蛋白质对肿瘤细胞的生长和肿瘤的发生发育有较强抑制作用。结论构建了NDRG4的PQE30/M15表达载体并取得高表达,表达蛋白质有较强抑瘤活性,为基因功能研究奠定了基础。     

真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

目的通过在大肠杆菌中表达真菌免疫调节蛋白LZ-8,以制备高效价的抗体。方法将所克隆的LZ-8基因构建成原核表达载体pET-30a-lz8,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后,采用常规方法制备家兔多克隆抗体,并用间接ELISA法测定阳性血清的效价。结果大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE电泳检测到相对分子量约为14ku的目的蛋白；用考马斯亮兰法测定所表达的外源蛋白表达量为34．46mg/L；纯化后的目的蛋白免疫家兔后,经间接ELISA检测阳性血清的稀释比例达到了10~4,证明该蛋白具有良好的抗原性。结论真菌免疫调节蛋白LZ-8能够在大肠杆菌中获得高水平的表达,且获得了高效价的家兔多克隆抗体,为以后对该蛋白的功能研究打下了基础。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达

将水蛭素12肽通过柔性肽(Gly)3与r-PA连接,以期望获得既具有抗凝活性,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子。采用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构与其活性区可以正常发挥功能。构建并表达了兼有溶栓和抗凝活性的瑞替普酶(r-PA)与水蛭素12肽双功能融合基因。通过两轮加端PCR获得水蛭素12肽与r-PA通过柔性肽(Gly)3连接得到的融合基因,再克隆到pET-21a载体上,经测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,融合蛋白约占菌体总蛋白的12%,以包涵体形式存在,经过体外复性后,融合蛋白的纤溶比活达到8 400.5 IU/mg,抗凝比活达到930.2 ATU/mg,具有较高的溶栓抗凝双功能活性。该双功能融合蛋白有望成为治疗血栓疾病的新型药物。