家稗丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及序列分析

为揭示C4植物家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight] PPDK结构和功能特点,探索改善作物高光效途径,采用RT-PCR技术,克隆了家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea (Roxb.) W. F. Wight]丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的cDNA全长。核苷酸序列分析表明, 该片段全长3 085 bp, 包含一个2 844 bp的ORF,编码948个氨基酸(GenBank登录号：AY 792619)。编码区核苷酸序列与高粱（Sorghum bicolor）、甘蔗（Saccharum officinarum）、玉米（Zea mays）等C₄型pdk基因同源率分别为85.1%、84.0%和82.0%;与水稻[Oryza sativa (japonica cultivar-group)] pdk基因同源性也高达82.6%。氨基酸序列进化树分析表明其与玉米、水稻等禾本科植物最为接近;半定量RT-PCR研究表明,pdk基因仅在绿色叶片中表达。     

小麦GAPDH 基因克隆及序列分析

采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH （甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxy corn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

基因克隆及序列分析

 采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH （甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

蒙古冰草Lea3抗旱基因片段的分离与鉴定

研究旨在利用同源序列法分离蒙古冰革抗旱基因同源片段。根据已知禾本科植物抗旱基因Lea第3组的保守区段设计一对简并引物,采用PCR方法对蒙古冰草幼苗的基因组DNA进行扩增。获得了1个蒙古冰草的抗旱基因Lea3基因片段,长度为497bp,包含124bp的非翻译区,共编码124个氨基酸。核苷酸序列分析表明,该序列与小麦抗旱基因LEA第3组的Wrad19同源性为93％,与小麦受ABA诱导的WRAB1基因同源性为93％;与一个来源于玉米mRNA的逆境胁迫基因克隆9124同源性为96％;与大麦受ABA诱导的pHVA1基因同源性为94％;与大麦HVA1基因同源性为91％。Southern杂交表明该基因在蒙古冰草基因组中以基因家族形式存在。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

参照GenBank中NDV的核酸序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增,基因并得到长约1.7 kb的全基因片段,并将其构建到pMD.19T载体上.核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长1 662 bp,编码553个氨基酸,与GenBank下载的13株参考毒株,基因比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%～99.2%和96.9%～98.7%;但与IJasota、F48E9及Bl等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为88.6%～91.5%.NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F-I-G119,属于基因Ⅵ NDV.     

甘薯和巴西牵牛18S rRNA基因的克隆和序列分析

【研究目的】为甘薯和侵染甘薯病毒的基因表达研究提供内参基因序列信息。【方法】分别以‘商薯19’、‘北京553’两甘薯品种和巴西牵牛的基因组DNA为模板,利用PCR方法克隆甘薯和巴西牵牛18S rRNA基因序列。【结果】测序结果表明,获得的供试两甘薯品种和巴西牵牛的18S rRNA基因序列长度均为1630 bp;序列比对结果表明,甘薯和巴西牵牛与裂叶牵牛、烟草等双子叶植物的18S rRNA基因相应序列的一致性均达98%以上,与单子叶植物Lilium superbum的18S rRNA基因序列也有较高的一致性。【结论】从两甘薯品种和巴西牵牛的基因组中克隆出了18S rRNA基因部分序列,研究结果不仅为利用18S rRNA基因作为内参基因分析甘薯和侵染甘薯病毒基因的表达研究提供了序列依据,而且可为甘薯和巴西牵牛的分子系统学研究提供序列参考。     

玉米BADH基因的克隆与序列分析

Betaine was accumulated as a nontoxic and protective osmolyte in water-dificit and salt-stressed plants. Betaine aldehyde dehydrogenase for glycine betaine synthesis is an important enzyme. The BADH gene of Maize was cloned by RT-PCR and RACE. The gene is 1 762 bp in length, including an open reading frame of 1 515 bp.Its nucleotide sequence shares 95% with the the partial cDNA of BADHI from Sorghum bicolor. Its deduced amino acid sequence contains the conserved domain sequence “VTLELGGKSP“ of ALDH, and a tripeptide SKL at its C-terminal, a signal targetting to the microbodies. The phylogenetic tree of 20 BADHs was constructed,which corresponds to the classical botanical division of plant, the BADH of maize is closest to the one of Oryza Sativa.     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

绵羊regakine-1基因的克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊regakine-1基因;【方法】肠系膜淋巴结组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析;【结果】克隆的绵羊regakine-1基因与牛的同源性为91%,推测的氨基酸序列信号肽为1~21aa,SCY结构域为29~87aa,结构特征与牛的相一致。【结论】克隆了绵羊regakine-1基因的ORF,并注册GenBank (AccessionEF617337)     

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

海南普通野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与分析

利用已知植物抗病基因NBS(Nucleotide binding site)序列中的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过T/A克隆、测序和序列分析, 共得到4条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistance gene analogues, RGAs)序列,它们之间核苷酸序列间的相似性系数在53.14%-99.81%之间,而相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在39.08%-99.42%之间。氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括“P-loop”、“Kinase-2a”、“Kinase-3a”和“GLPL”4个抗病基因所共有的保守模体,并且4条海南普通野生稻NBS-LRR类似物均属于nonTIR-NBS类抗病基因片段。