CVB3cDNA重组质粒pGP51B转化作用的实验研究

以大肠杆菌ＨＢ１０１菌株为受体菌，研究了ＣａＣｌ２浓度，转化时间及转化 温育时间对柯萨奇Ｂ组病毒３型ｃＤＮＡ重组质粒ｐＧＰ５１Ｂ转化作用的影响。实验结果表明，ＣａＣｌ２浓度和转化时间对转化率的影响极为显著，而转化后的能时间对转化率的影响不明显。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

EB病毒特异的胸苷激酶基因在大肠杆菌中的表达

３０℃培养基因工程菌，迅速转移至４２℃培养４ｈ诱导重组质粒中外源ＥＢ病毒胸苷激酶（ＥＢＶＴＫ）基因的表达。菌体蛋白作十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析表明，重组蛋白分子大小与ＥＢＶＴＫ分子大小的理论值６７ｋｕ相符，占菌体总蛋白的６％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明重组蛋白可与混合ＮＰＣ病人血清中ＥＢＶＴＫ特异性抗体反应，呈现良好的抗原性。以３ＨｄＴ为底物测定菌体总蛋白的ＴＫ比活性，结果提示，重组蛋白具有胸苷激酶活性。研究为ＥＢＶＴＫ在ＮＰＣ诊断中的应用打下了基础。     

HBV—前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转？…

目的：探索最佳ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染２．２．１５细胞的转化条件。方法：构建含ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒后,通过控制质粒ＤＮＡ浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果：在电压２１０Ｖ、电容９７５ｕＦ、温度４℃、ＤＮＡ终浓度在０．１２５μｇ／μｌ至０．７５μｇ／μｌ之间时,细胞转染生长情况最佳。结论：上述优化实验条件,可明显提高Ｈ     

头尾串联拷贝HBV DNA重组体的构建

为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立ＨＢＶ复制状态的真核表达载体,利用Ｂａｍ ＨＩ与Ｂｇｌ Ⅱ粘端互补的特点,将经Ｂａｍ ＨＩ线性化的ＨＢＶ ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）克隆于表达新霉素基因的载体ｐｃＤＮＡ３的Ｂａｍ ＨＩ与ＢｇｌⅡ位点间,获得含头尾串联双拷贝ＨＢＶ基因组的重组质粒。     

糖尿病基因治疗的实验研究I.人胰岛素基因真核细胞表达…

为有效开展糖尿病基因治疗，作为第一步，本研究构建了人胰岛素原基因与表达载体ＰＲＣ／ＣＭＶ的重组体。首先，从质粒ＰＢＣＡ中酶切回收２６０ｂｐ的人胰岛素原基因片段，利用中间载体ＰＢＳ．ＳＫ构建了含人胰岛素原基因片段的过渡质粒ＰＢＳ．ＩＮＳ，在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体ＰＲＣ／ＣＭＶ．ＩＮＳ。     

新型大肠杆菌—分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因？…

用ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅｃａｔｉｏｎ）技术克隆了卡介苗（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）热休克蛋白６５（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６５，ｈｓｐ６５）启动子序列，构建成穿梭载体ＭＥ－６５。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因，ＢＣＧ的ｈｓｐ６５高效启动子序列以有在分析杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因，将其转化到耻垢分枝杆菌和ＢＣＧ中均可     

实验性病毒性心肌炎药物治疗及凋亡的机制

目的以病毒性心肌炎（ＶＭＣ）细胞感染模型为基础，研究柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）细胞感染与心肌细胞凋亡的关系，并观察板蓝根对实验性ＶＭＣ的治疗效果。方法第一步建立稳定的ＶＭＣ细胞感染模型；第二步在ＣＶＢ３病毒感染心肌细胞后２４ｈ电镜观察超微结构改变，流式细胞仪检测“凋亡峰”，ＥＬＩＳＡ法定量检测ＣＶＢ３病毒感染后１，２，４，７，２４ｈ心肌细胞凋亡的情况；第三步将不同浓度的板蓝根与ＣＶＢ３病毒作用后在心肌细胞上检测病毒的ＴＣＩＤ５０。根据药物毒性测定的结果，取最大无毒浓度以下两种不同浓度的板蓝根按两种方式加药：（１）ＣＶＢ３病毒感染细胞后加药；（２）病毒先与药物作用后再感染细胞进行实验。以黄芪作为治疗阳性对照组，另设病毒感染组、正常细胞对照组。于药物作用４８ｈ后观察各组细胞搏动百分比、细胞病变（ＣＰＥ）、超微结构变化，并测定培养液中心肌酶水平，进行体外、细胞内药物疗效观察。结果（１）对ＣＶＢ３病毒感染后细胞的形态学检测（ＣＰＥ３＋～４＋），电镜下细胞内见包涵体，病毒颗粒及细胞培养液心肌酶（ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＣＫ、ＣＫＭＢ、ＨＢＤＨ）水平升高，证实所建立的ＶＭＣ细胞感染模型是稳定的。（２）电镜观察ＣＶＢ３病毒感染心     

卡介苗基因组的克隆

以质粒ｐＧＣ１９为载体克隆了卡介苗（即卡介菌，ＢＣＧ）ＤＮＡ。Ｓａｕ３Ａ１部分酶解ＢＣＧ ＤＮＡ，通过琼脂糖电泳分离２￣９ｋｂＤＮＡ片段。ＢａｍＨ１酶切质粒ｐＵＣ１９，碱性磷酸酶去磷酸化，２￣９ｋｂＤＮＡ片段与ｐＵＣ１９载体用Ｔ４连接酶连接转化大肠杆菌ＨＢ１０１，在含氨苄青霉素（Ａｍｐ）、５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷的ＬＢ平板上获得Ａｍｐ白色转化子。随机挑选１２个转化子快速提取重组子     

EB病毒特异的胸苷激酶基因在大肠杆菌中的表达

３０℃培养基因工程菌，迅速转移至４２℃培养４ｈ诱导重组质粒中外源ＥＢ病毒胸苷激酶基因的表达。菌体蛋白作十二烷基硫酸钠－聚丙烯酸胺凝胶电泳分析表明，重组蛋白分子大小与ＥＢＶ ＴＫ分子大小的理论值６７ｋｕ相符，占菌体总蛋白的６％以上。     

不同动物的不同脑供血动脉结扎后存活率比较

目的：选择合适动物建立脑缺血模型。方法：结扎左侧或右侧颈总动脉；结扎双侧颈总动脉；结扎双侧椎动脉和双侧颈总动脉。结果：（1）结扎兔和SD大鼠左侧或右侧颈总动脉，不影响其存活；（2）结扎双侧颈总动脉后的SD大鼠，其中2／3以上动物在术后1－7d内死亡，虽然有2只大鼠存活10d，但体质消瘦；（3）结扎沙土鼠左侧颈总动脉后，有1／2的动物在5－12h内死亡；结扎双侧颈总动脉的沙土鼠，术后2－5h内全部死亡；（4）结扎SD大鼠4动脉（双侧椎动脉和双侧颈总动脉）后，其中约1／3在术后2－5h内死亡，约2／3在术后12h内死亡，另有2只在24h后死亡。结论：因大鼠的脑血管配置与人类近似，最好选用大鼠做脑缺血模型。     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ＰＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因，快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＥＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＥＣ物理图谱上３．２ｋｂ至４．８ｋｂ区间内，其分隔量约１．６ｋｂ。     

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

丝线结扎及局部涂抹牙龈卟啉单胞菌对小鼠牙槽骨骨吸收的影响

目的： 比较丝线结扎和涂抹牙龈卟啉单胞菌诱导小鼠牙周炎模型的牙槽骨骨吸收程度、激活破骨细胞及去除诱因后成骨的过程。方法： 48只C57BL6小鼠随机分配,采用分口设计,根据涂抹2%（质量分数）羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose, CMC）或109个菌落形成单位（colony-forming units, CFU）的牙龈卟啉单胞菌以及是否丝线结扎分为4组（n= 24）,分别为对照组（右上第二磨牙单纯涂抹CMC）、丝线结扎组（围绕左上第二磨牙结扎9-0丝线）、涂菌组（右上第二磨牙单纯涂抹牙龈卟啉单胞菌）和丝线结扎+涂菌组（结扎左上第二磨牙并涂抹牙龈卟啉单胞菌）,测量釉牙骨质界至牙槽骨嵴顶（cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC）的距离,监测牙槽骨的吸收。48只C57BL6小鼠设计和分组同上,牙槽骨骨面的破骨细胞采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色并计数。36只C57BL6小鼠随机分配,其中30只小鼠在左侧上颌第二磨牙结扎9-0丝线,观察3周,有12只小鼠在丝线结扎1周后拆除丝线,继续观察2周,分别在丝线结扎1、2、3周以及丝线拆除1周和2周共5个时间点（n=6）各处死6只小鼠,检测CEJ-ABC距离;未行丝线结扎的小鼠CEJ-ABC距离（n=6）为基线水平。采用单因素方差分析（ANOVA）法对所有数据进行统计学分析。结果： 丝线结扎组的小鼠牙周炎,在3、6、9和12周后的CEJ-ABC距离分别为（0.16±0.04） mm、（0.16±0.02） mm、（0.18±0.03） mm、（0.17±0.02） mm,与对照组［（0.09±0.03） mm、（0.10±0.01） mm、（0.12±0.04） mm、（0.12±0.01） mm］和涂菌组［（0.09±0.03） mm、（0.12±0.01） mm、（0.12±0.02） mm、（0.10±0.01） mm］相比差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组［（0.09±0.03） mm］相比,丝线结扎组第3周的CEJ ABC距离为（0.16±0.04） mm,比涂菌组［（0.09±0.03） mm］诱导的牙槽骨骨吸收更迅速,丝线结扎和涂抹牙龈卟啉单胞菌结合并未进一步增加牙槽骨的吸收破坏。在丝线结扎1 d后,牙槽骨表面的破骨细胞即被激活,与对照组［（2±2）个］相比在第3天达到高峰［（12±4）个,P<0.01］。丝线结扎诱导的小鼠牙周炎,在丝线去除2周后CEJ-ABC距离为（0.07±0.02） mm,与去除丝线前［（0.13±0.01） mm］相比显著降低,提示有显著的牙槽骨再生（P<0.01）。结论： 丝线结扎术是一种迅速且有效的诱导小鼠牙周炎牙槽骨骨吸收的方式,其诱导的破骨细胞活化在丝线结扎后24 h内发生,3 d达到高峰,去除实验性牙周炎的诱导因素即去除结扎的丝线有助于牙槽骨骨再生。     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b( ),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b( ),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.     

重组质粒的快速酚筛法的改进

介绍一种重组质粒的粗筛技术，该法简便，快速，经济、有效、特别适用于单酶切，钝端连接及T－载体连接的重组质粒。     

pSUPER-2H1重组双靶向干扰载体的构建及鉴定

目的构建含有双H1启动子的重组pSUPER-2H1质粒载体,为进一步构建同时干扰LRP和P—gp基因的RNAi载体做基础。方法以pSUPER质粒中原有的H1启动子为模板PCR扩增H1启动子,将扩增的H1启动子连接到Pumc-T载体上,重组的质粒载体命名为Pumc—T—H1。将pSUPER质粒与Pumc—T-H1利用xhoI和salⅠ进行双酶切,将两者的酶切产物连接后转化大肠杆菌DH5a,抽提后的重组质粒载体命名为pSUPER-2H1,并对其进行酶切鉴定和测序。结果经酶切鉴定及测序证实克隆入pSUPER质粒的H1启动子与pSUPER质粒中原有的H1启动子序列一致,从而成功构建了pSUPER-2H1重组质粒。结论pSUPER-2H1重组质粒的构建为下一步LRP和P—gP基因双干扰RNAi重组质粒的构建奠定了基础。     

Expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in HepG2 cell line

AlthoughthegenomeofseveralstrainsofhepatitisCvirus(HCV)havebeenclonedandscquenced,theHCVparticleshavenotbeenobservedsofar.Currently,becauseofverylowInfectionefficiency,oneofthemajorimpedimentstothestructuralanalysisofHCVgenomeandgeneticanalysisofviralreplicationisthelackofareliablecellculturesystempermissiveforH(IVreplicanon.Inthisstudy,usingrecomblnantDNAtechnlque,weconstructedarecombinantplasmidbysubcloningcoregenecDNAofChineseH(7VisolateIntoaeukaryoticexpressionvectorPTM3andexpres…