钩端螺旋体外膜菌苗的研究

采用C－70培养基培养钩端螺旋体可提高钩体浓度4．5～11．6倍。参照Auran方法进行提纯，采用中空纤维超滤技术收集外膜制成外膜苗苗。接种一针（30μg）即可达到最低免疫水平，表明外膜苗有较强的免疫原性。尽管疫苗中残留微量SDS，但动物试验安全，未出现异常反应。其它检定项目结果均符合构体菌苗制检现程要求。     

钩端螺旋体外膜蛋白基因重组载体构建及在卡介菌中的表达

目的　研制一种高效广谱的新型钩体疫苗。方法　用PCR方法扩增致病性钩端螺旋体赖型 0 17株外膜蛋白OmpL1基因 ,将其克隆入大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒载体pMV2 6 1和pMV36 1中。结果　筛选到两个重组载体pBQ1和pBQ2 ,通过电穿孔导入卡介菌 ,重组体经诱导表达了相对分子质量约为 35 0 0 0的融合蛋白。结论　卡介菌能有效表达钩体抗原蛋白     

钩端螺旋体的生长与pH变化

采用Tris和磷酸盐缓冲液制备无蛋白综合培养基，观察钩体生长与pH变化。结果表明：Tris缓冲液制备的培养基稳定性优于磷酸盐缓冲液．钩体生长的最适pH为7．2～7．5。钩体生长条数在前4天中呈几何级数增长，第8天达到高峰，约109/ml，10天后缓慢下降。与此相反，pH开始是逐日下降。培养到第5天降到最低值，约7.0，以后逐渐回升。     

钩端螺旋体疫苗大面积接种的流行病学效果

目的　评价钩端螺旋体疫苗大面积人群免疫的流行病学效果。方法　采用队列研究方法对重点疫区乡镇钩体流行年份钩体疫苗的保护率和效果指数进行分析。结果　钩体疫苗的保护率为 85 34%～ 10 0 % ,效果指数为 6 82～ 36 5 9。结论　现行的钩体疫苗具有较好的流行病学效果     

钩端螺旋体疫苗部分菌种分子特性及毒力分析

目的分析钩端螺旋体(简称钩体)疫苗部分菌种的分子特性及毒力。方法应用多位点可变数量串联重复序列分析(multi locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)方法,结合脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)技术,分析我国4株钩体疫苗弱毒株的分子特性;通过豚鼠动物模型攻击实验分析4株弱毒株的毒力。结果 4株钩体疫苗弱毒株经MLVA分析呈现4种不同的型;PFGE分析显示,经NotⅠ酶切,染色体呈现8～13个长度不等的片段;所有经弱毒株攻击动物的主要脏器均出现典型的钩体感染病变。结论明晰了4株钩体疫苗弱毒株的分子特性及其对豚鼠的毒力,为完善该疫苗菌种的质量控制积累了资料。     

钩端螺旋体疫苗鉴别试验及其国家参考品的建立

目的建立钩端螺旋体疫苗鉴别试验方法,制备系列免疫血清作为国家参考品。方法应用疫苗生产用菌株免疫家兔,制成免疫血清,冻干后进行标定,并经上海生物制品研究所和武汉生物制品研究所两单位采用试管凝集试验进行验证。结果冻干参考品血清效价符合要求,协作标定14批钩端螺旋体疫苗,结果一致。结论所制备的冻干参考品合格。钩端螺旋体疫苗鉴别采用试管凝集试验是可行的。     

高效液相色谱法测定钩端螺旋体疫苗中的苯酚含量

目的采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定钩端螺旋体疫苗中的苯酚含量。方法色谱条件:色谱柱:Novo-Pak C-18层析柱(3.9 mm×150 mm,4μm),流动相:甲醇-超纯水(40∶60,v∶v),流速:1.0 ml/min,检测波长:270 nm,柱温:30℃,进样量:10μl。对建立的方法进行线性范围、精密性、重现性、准确性验证及初步应用。结果苯酚浓度在18.552¹29.864μg/ml范围内,色谱峰面积与苯酚浓度呈良好的线性关系(r=0.999 7);苯酚对照品溶液连续进样6次,主峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.25%,保留时间的RSD为0.10%;用建立的方法检测6份钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的RSD为0.5%;准确性试验的总平均回收率为100.6%,RSD为1.0%;HPLC法和溴量滴定法测定4批钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的结果基本一致。结论 HPLC法可以更准确地测定苯酚含量,且该方法操作简便、快速,精密性高,重现性好,无干扰,适用于钩端螺旋体疫苗成品中苯酚含量的检测。     

钩端螺旋体黄疸出血群赖株LipL41基因的克隆表达及鉴定

目的　对钩体黄疸出血群赖株LipL4 1基因进行克隆、表达及鉴定。方法　采用高保真PCR ,从我国钩体黄疸出血群赖株基因组中扩增全长LipL4 1基因片段 ,并构建原核表达系统。结果　所克隆的LipL4 1基因核苷酸和氨基酸序列与已发表LipL4 1基因序列 (GenbankL4 6 794 )同源性分别为 96 2 5 %和 98 87% ;所表达的目的蛋白经Westernblot证实为具有良好免疫反应性的广谱抗原。结论　可作为研制基因工程疫苗的候选抗原     

中国莱姆病螺旋体PD91重组外膜蛋白A的动物免疫效果分析

目的观察重组中国莱姆病螺旋体Borrelia garinii基因型外膜蛋白A(rOspA)的动物免疫效果。方法采用纯化的rOspA作抗原,以新西兰家兔、绵羊和犬为试验动物,分不同剂量组和对照组进行免疫,用间接免疫荧光法(IFA)检测其血清特异性抗体(IgG),并进行体外中和试验。结果用rOspA免疫新西兰家兔、绵羊和犬后,其血清抗体(IgG)效价较免疫前均显著升高,其几何平均滴度为1∶169,体外中和试验表明,每毫升兔抗rOspA血清可杀灭1.0×105个莱姆病螺旋体;绵羊和犬的抗rOspA血清杀菌能力因免疫剂量的不同而不同,每毫升绵羊和犬抗rOspA血清最高可杀灭1.0×106个莱姆病螺旋体。结论rOspA有较好的免疫原性,可作为中国莱姆病rOspA亚单位疫苗的一种有效成分。     

问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建

目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。     

1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体病流行菌株与其同血清群疫苗株的比较基因组学分析

目的 对1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体（简称钩体）病流行菌株与其同血清群疫苗株进行比较基因组学分析。方法 应用高通量测序技术对黄疸出血群钩体流行株200502（简称流行株200502）进行全基因组序列测定,并与其同血清群疫苗株56601进行比较基因组学分析;选取GenBank中已公布的包括疫苗株56601在内的9株不同基因种的代表性钩体菌株构建系统发育进化树。结果 流行株200502全基因组序列全长为4 543 190 bp,含有编码基因3 580个,其中具有直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）功能2 192个。流行株200502与疫苗株56601基因组平均核苷酸一致性为99.2%,存在共有基因3 245个,流行株200502含有特有基因242个。以疫苗株56601为参考,在流行株200502中共鉴定出2 005个插入缺失（indel）和19 799个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点,其中编码区有8 485个同义SNP位点、3 484个非同义SNP位点,涉及菌株的细胞运动、信号转导机...     

外膜蛋白C作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡表面的可行性

目的 探讨外膜蛋白C(outer membrane protein C,OmpC)作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡（outer membrane vesicle,OMV）表面的可行性。方法 构建含有ompC基因片段及金黄色葡萄球菌EsxA抗原基因（esxA基因）的重组表达质粒,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析。提取重组菌OMV,经12%SDS-PAGE分析OMV总蛋白,并采用Western blot法和纳米流式仪检测融合蛋白定位至OMV表面的情况。结果 含ompC基因和esxA基因的重组表达质粒经测序证明构建正确。融合蛋白OmpC-EsxA经12%SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约57 000的目的蛋白条带,大小与预期相符。OMV总蛋白经12%SDS-PAGE分析,可见多条蛋白条带,表明成功提取重组菌OMV。重组菌OMV表面的融合蛋白OmpC-EsxA可与小鼠抗His-Tag抗体发生特异性结合,且纳米流式仪可检测到荧光抗体标记的OMV。结论 OmpC可作为蛋白呈递平台将抗原定位至OMV表面,有望应用于抗...     

6省市28株钩体菌株血清学检定及2个新型菌株的发现

目的　为了解洪涝灾害对钩端螺旋体 (钩体 )病流行菌型的影响 ,在我国钩体病流行比较严重的省市地区进行菌株分离观察。方法　采用经典的显微镜凝集试验和交叉凝集素吸收试验进行血清学分类比较。结果　 6省市的 2 8株钩体菌株分属 7个血清群 9个血清型 ,其中发现 2个新的血清型 ,暂定为贺岩型和沅江型 ,代表菌分别为L2 31株和沅江 2 7株。结论　对流行区的 2 8株钩体菌株进行了血清学分类 ,为钩体病的诊断提供了新的依据。     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的研究

本文以简化的方法从伤寒沙门氏菌Ty2菌苗株制备外膜蛋白(Outer membraneprotein,简写为OMP),OMP的生化检测显示主要为蛋白质,并有少量LPS污染,不含有Vi多糖。由SDS-PAGE显示OMP为一组分子量介于17～70KD的蛋白质,其中分子量为36～41KD左右的蛋白带为主要蛋白带。OMP有良好的免疫原性和抗原性,不加佐剂免疫动物可产生高效价抗血清,玻片凝集试验能与不同类型抗原结构的伤寒沙门氏菌凝集,但这种凝集可因细菌Vi抗原的存在而被阻抑。动物试验表明OMP有良好的免疫原性,自动和被动免疫力试验均能对小鼠有良好的保护作用,表明OMP是一种保护性抗原。动物热原试验和体重减轻试验及毒性试验均符合有关要求。     

绿脓杆菌外膜蛋白对感染的保护作用

目的 寻找一种防治绿脓杆菌感染的有效方法。方法 用绿脓杆菌外膜蛋白免疫的兔抗血清对4种不同血清型的菌株和1株临床绿脓杆菌进行体内外交叉保护性试验。结果 家兔免疫1周后即产生抗体,并逐渐升高,至第6周抗体滴度达到1:163 840,并维持高水平;抗血清能与4种不同血清型菌株和1株临床菌株产生直接凝集反应。第8周的血清(1:8以上)与其外胰蛋白的ELISA抗体效价相近,小鼠的半保护剂量均在0.05～0.11ml之间。结论 外膜蛋白疫苗具有较强的抗原性,而且具有良好的交叉保护作用。     

问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征分析

目的　分析问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法　根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库 ,应用BLAST ,Tmpred ,Pfam等软件分析问号钩体Ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征 ,并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌K12Ⅱ型分泌系统组成蛋白的同源性。结果　问号钩体中与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有 11个 ,其中 6个为一般分泌途径蛋白 ,5个为Sec分泌途径蛋白 ,问号钩体中可能存在Ⅱ型分泌系统 ,但一些辅助蛋白未发现 ,需要进一步研究。结论　初步预测了问号钩体中Ⅱ型分泌系统的作用模式 ,为深入研究问号钩体的致病机制奠定基础     

梅毒螺旋体特异抗原TP0684的克隆和表达

目的克隆并表达梅毒螺旋体外膜蛋白TP0684,为研制早期诊断试剂盒提供依据。方法PCR法扩增TP0684编码基因。T-A克隆后构建表达质粒pET-22b(+)-TP0684,经酶切鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了1212bp的目的片段,原核表达质粒pET-22b(+)-TP0684酶切鉴定正确,测序结果与GenBank上公布的该基因的CDS序列完全一致。转化E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约43000,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TP0684重组蛋白具有良好的免疫反应性,为进一步研究梅毒血清学诊断试剂奠定了基础。     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的分离和鉴定

用 Triton X-100处理伤寒沙门氏菌外膜,经3次超离后从上清液中获得外膜蛋白(OMPs)。SDS-PAGE 显示,OMPs 蛋白带的分子量在17～70KD 间,其中分子量为36～41KD的主要蛋白占总 OMPs 的50～60%。经测定2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的含量间接测得,OMPs 中脂多糖(LPS)的污染量约为4%。用 OMPs 免疫家兔,抗体效价琼脂双扩散法为1:64,ELISA 法为1:12 500。免疫印迹法显示,兔抗-OMP 血清主要与 OMPs 中的主要蛋白发生反应。     

鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白(porin)的提纯及鉴定

采用超声破碎、TritonX－100溶解、Sephacryl超细S－300和SephadexG－150凝胶过滤提纯了鼠伤寒杆菌的外膜蛋白porin。经检测其中LPS的含量约为0．06％。经SDS—PAGE图谱分析，porin在36KDa位置处显示一条蛋白带；用免疫印迹将OMPs兔抗血清与porin结合，仅在36KDa位置显示一明显的印迹带。     

霍乱弧菌外膜蛋白抗原的共同性和特异性

通过免疫吸收试验证明,不同生物型和血清型的霍乱弧菌外膜蛋白(OMP)是共同抗原,它们之间可互相完全吸收,共同抗原是分子量约为47K和86K的IA组分。OMP和IA组分对01霍乱弧菌是特异性抗原,其抗IA血清经LPS吸收只能与霍乱弧菌发生阳性反应,与NAG和其它革兰氏阴性菌的参试株不发生阳性反应。霍乱弧菌LPS是与革兰氏阴性菌发生交叉反应的物质,以LPS为基础制备的多价血清及其分型血清,难免发生非特异的交叉反应。