异种同源钙激活Cl-通道DNA疫苗抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌的研究

目的 钙激活Cl^-通道(CLCA)家族中小鼠mCLCA3与人hCLCA1是异种同源蛋白,两者表达于气道上皮杯状细胞。拟探讨hCLCA1 DNA疫苗对哮喘小鼠气道黏液高分泌状况的影响。方法 构建重组真核表达质粒pSecTag2B／hCLCA1,将其作为疫苗肌注法接种给BALB／c小鼠(隔2周1次,共4次)。当酶联免疫吸附法(ELISA)证实血清中有能结合mCLCA3胞外肽段(ED)的抗体产生时,卵蛋白致敏法制备接种小鼠的哮喘模型。引喘5d后,PAS特染黏蛋白法观察气道杯状细胞数量及分泌功能,逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)法检测黏蛋白MUC5AC mRNA水平的变化。设接种pSecTag2B／mCLCA3、空载体pSecTag2B和生理盐水为对照组。结果 ELISA证实疫苗接种3次后的小鼠血清抗体,能有效结合mCLCA3的3个ED。其中抗体与N-端和C-端ED的结合滴度大于与中间ED的结合滴度。与同样被诱发哮喘的对照组相比,疫苗接种组小鼠气道的杯状细胞数量和黏液分泌量明显减少,MUC5AC mRNA转录水平下降。结论 hCLCA1 DNA疫苗能诱导小鼠产生结合自身mCLCA3胞外肽段的抗体,并因此有效减轻了哮喘气道黏液高分泌。     

慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮水通道5的表达与黏液高分泌

目的 通过检测慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气道上皮水通道5（AQP5）和黏蛋白MUC5AC、黏膜下腺黏蛋白的表达，探讨COPD患者气道黏液高分泌的机制。方法 取2004年华西医院胸外科手术病人离体标本，根据术前检查结果将患者分为轻度COPD组（8例）、中重度COPD组（17例）和对照组（20例），分别用RT-PCR、原位杂交、免疫组化、阿辛兰．PAS染色检测气道上皮细胞AQP5、MUC5AC以及黏蛋白的表达。结果 与正常对照组相比较，COPD组患者黏膜下腺AQP5表达低于对照组（P〈0．01），两组患者肺组织AQP5表达差异无统计学意义（P〉0．05）；中重度COPD组患者黏膜下腺AQP5表达低于轻度COPD组（P〈0．01）。COPD组患者气道上皮MUC5AC表达高于对照组（P〈0．01），中重度COPD组患者气道上皮MUC5AC表达高于轻度COPD组（P〈0．01）；COPD组黏膜下腺分泌黏蛋白较对照组增加（P〈0．01），中重度COPD组患者黏膜下腺分泌黏蛋白表达高于轻度COPD组（P〈0．01）。黏膜下腺AQP5mRNA表达与患者FEV1／FVC、FEW1％pred、V50％pred、V25％pred呈正相关（r分别为0．60，0．60，0．55和0．45，P均〈0．01），AQP5的表达减弱与COPD患者的气道气流受限严重程度有关；与患者气道上皮MUC5ACmRNA表达呈负相关（r=-0．45，P〈0．01）；与黏膜下腺着色面积呈负相关（r=-0．61，P：0．01）。气道上皮MUC5ACmRNA表达与患者FEV1／FVC、FEV1％pred、V50％pred、V25％pred呈负相关（r分别为-0．53，-0．53，-0．48和-0．43，P均〈0．01）；与黏膜下腺黏液着色面积呈正相关（r=0．43，P〈0．05）。结论 COPD患者的黏膜下腺AQPs较对照组表达降低，AQPs可能参与了COPD患者气道黏液分泌的调节。     

钙激活CI-通道阻断剂尼氟灭酸对哮喘小鼠气道高反应性的抑制作用

【目的】观察钙激活CI-通道(CICa)阻断剂尼氟灭酸(NFA)对支气管哮喘气道高反应性的抑制作用。【方法】将小鼠分为哮喘组(A组),吸入NFA预防组(B组)和正常对照组(C组),每组15只。用多道生理记录仪记录气道压力峰值-时间指数(APTl)的差异,并比较各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中内皮素1(ET-1)和一氧化氮(NO)的含量。观察在梯度浓度乙酰甲胆碱(mACh)的激发下,50μmol/L NFA预处理对气管环收缩张力的影响。【结果】A组APTl与B组比较,差异有显著性(P<0.01);BALF中ET-1和NOA组与B组比较差异有显著性(P<0.01);离体气管环收缩张力实验显示,A1组与C1组、A1组与A2组比较差异有显著性(P<0.01)。表明NFA能显著降低A1组的张力。【结论】NFA对哮喘气道高反应性有显著抑制作用。通过阻断气道上皮特异性ClCa,导致上皮细胞产生ET-1和NO减少,是NFA发挥抑制效应的机制之一。     

钙激活性氯离子通道抑制剂对肺动脉平滑肌作用的研究进展?

1 肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的钙激活性氯离子通道(CaCCs)与跨膜蛋白16A(TMEM16A)
　　肺血管张力维持需要 CaCCs 参与。人们对不同组织(包括肺动脉)中平滑肌细胞上 CaCCs 进行了广泛研究,发现其通道活性在维持肺血管张力中起着重要作用[1-2]。     

CLCA1的功能及在疾病中的作用研究进展

钙激活氯通道调节剂1(CLCA1)是一种分泌型自催化裂解的蛋白质,属于CLCA家族的一员,它能够激活哺乳动物细胞中钙依赖的氯离子电流,并具有锌金属蛋白酶特性。通过发挥其金属蛋白酶和阴离子通道激活作用,CLCA1在呼吸系统和消化系统黏液高分泌相关疾病如支气管哮喘、溃疡性结肠炎的发病机制中起重要作用。同时,由于其上皮细胞氯离子及其他阴离子的传导调节作用而参与恶性肿瘤发生发展进程。本文就CLCA1的分子结构、相关特性以及与相关疾病的关系研究进展作一综述。     

氯离子通道研究进展

氯离子是体内最重要最丰富的阴离子, 它进出细胞的过程, 除了与氯离子 相关的一些转运体主动转运外, 经过阴离子通道进行转运是重要方式之一。氯离子通道组织分布广泛,参与了众多的生理过程：包括细胞体积的调节、膜电位的稳定性调节、信号转导以及跨上皮运输等。文章重点综述了钙激活氯通道和容积调节氯通道的生理功能及分子基础,简单介绍了电压门控氯通道、囊性纤维跨膜电导转运体及配体门控氯通道。     

钙激活氯通道密度调节Anoctamin 1电流作用的研究

目的研究钙激活氯通道(CaCCs)密度对CaCCs蛋白—Anoctamin 1(Ano1)电流特性的调节作用,探讨高表达Ano1促进肿瘤发生的机制。方法瞬时转染Ano1质粒到HEK293细胞,高密度CaCCs通过表达Ano1 24 h获得,低密度CaCCs通过表达Ano16 h获得。膜片钳方法检测钙离子激活的Ano1的全细胞电流。激活电流曲线以指数曲线拟合。结果 Ano1质粒表达6 h的电流密度显著低于表达24 h的电流密度(P<0.05)。在低CaCCs密度时,Ano1的激活电流曲线最适于用单指数拟合,τslow为(292.71±38.11)ms。在高CaCCs密度时,Ano1的激活电流曲线最适于用两指数拟合,τfast为(47.78±4.58)ms;τslow为(385.74±71.44)ms。高CaCCs密度下的Ano1电流比低CaCCs密度下的Ano1电流多了一个快速激活成分(τfast),而高CaCCs密度与低CaCCs密度比较Ano1的τslow差异没有统计学意义(P>0.05)。结论 CaCCs的密度可调节Ano1激活的动力学变化;高表达Ano1可促进CaCCs的激活。     

胃肠道间质瘤患者Ki-67和钙激活通道蛋白1表达与预后的关系

目的 分析胃肠道间质瘤（GIST）患者Ki-67和钙激活通道蛋白1(DOG-1)表达与预后的关系。方法 对杭州师范大学附属医院2018年1月—2021年12月收治的107例GIST患者的临床资料进行回顾性分析,通过Kaplan-Meier法绘制不同Ki-67和DOG-1表达水平下GIST患者的累积生存率曲线,通过ROC曲线分析Ki-67和DOG-1对GIST患者预后的预测价值。结果 Ki-67高表达和DOG-1阳性表达与肿瘤直径、肿瘤转移、核分裂象计数、美国国立卫生研究院（NIH）危险度分级密切相关（均P<0.01）;Kaplan-Meier分析显示,Ki-67低表达患者和DOG-1阴性患者累积生存率分别高于高表达患者和阳性患者,差异均有统计学意义（均P<0.05）;ROC曲线分析显示,Ki-67和DOG-1表达水平预测GIST预后的AUC分别为0.847和0.940(P<0.01)。结论 Ki-67和DOG-1对GIST预后分别具有中等和较高预测效能,可作为重要预后影响因子,结合核分裂象计数和NIH危险度分级综合评估患者预后,可增进患者获益。     

心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特性

目的研究急性分离小鼠心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特征.方法采用膜片钳单通道(细胞贴附式和内面向外式)方法,记录急性分离的小鼠心肌细胞暴露于低渗溶液时出现的肿胀激活氯通道电流(ICl.swell).结果等渗状态下,用细胞贴附式记录,多数心肌细胞膜片无通道活动,用低渗溶液灌流细胞,在细胞容积增大的同时,出现单通道电流的激活.该肿胀激活单通道氯电压在-100mV~+100mV均有激活.在电压+100mV时,其单通道电导为(38.1±2.5)pS,开放概率为0.76±0.08,电流-电压曲线显示其反转电位(-34.5±2.8)mV,接近氯离子平衡电位的理论值(ECl=-38.6mV),且反转电位随氯离子浓度的改变而改变.氯通道阻断剂DIDS可逆性阻断该单通道电流.结论小鼠心肌细胞肿胀激活氯通道的单通道电导为(38.1±2.5)pS,电流呈外向整流特征并对DIDS敏感.     

阳和平喘颗粒对哮喘大鼠气道黏液高分泌的影响

目的 观察阳和平喘颗粒对哮喘大鼠气道黏液高分泌的干预作用,探究其作用机制.方法 将50只清洁级SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组,每组10只.采用卵清蛋白成功诱发大鼠哮喘后,并予相应药物干预8周.阿尔辛蓝过碘酸雪夫氏染色,光镜下观察气道杯状细胞;采用免疫组织化学法检测大鼠气道黏蛋白5AC（mucin 5AC,MUC5AC）的表达水平;采用Western blot、RT-PCR分别检测大鼠肺组织转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）蛋白及其mRNA表达水平.结果 阳和平喘颗粒高、低剂量组及地塞米松组大鼠气管可见少量黏液分泌,未见明显杯状细胞增生;与模型组比较,阳和平喘颗粒高、低剂量组及地塞米松组大鼠气道组织杯状细胞面积和MUC5AC蛋白表达水平,以及肺组织TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）;阳和平喘颗粒高剂量的效应显著优于低剂量,呈现明显的剂量依赖性（P＜0.01）.结论 阳和平喘颗粒可降低哮喘大鼠气道黏液高分泌,机制可能与其下调肺组织TGF-β1蛋白及其基因表达水平,抑制MUC5AC生成有关.     

规范化分级治疗对哮喘患者生活质量的影响

目的　评价全球哮喘防治创议 (GINA)推荐的分级治疗对哮喘患者生活质量的影响。方法　采用St George s呼吸疾病问卷 (SGRQ)和简明健康状况调查表 (SF 36 )量表 ,测量 31例哮喘患者按GINA推荐的分级方案治疗 3个月前后的生活质量 ,其中 ,2 4例哮喘患者同时测量肺功能 ,包括第 1秒用力呼气容积 (FEV1 )、FEV1 占预计值 %(FEV1 %pre)和呼气流量峰值 (PEF)。结果　支气管哮喘患者经GINA推荐的分级方案治疗 3个月后 ,肺通气功能和生活质量均改善。治疗前后SGRQ和SF 36得分均值比较 ,除了SF 36维度躯体疼痛外 ,其它观察指标均有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;治疗前后肺通气功能FEV1 、FEV1 %pre和PEF均有显著性差异 (P <0 . 0 5 )。结论　生活质量是反映哮喘控制目标的重要指标。GINA推荐的分级治疗可改善哮喘患者肺通气功能指标FEV1 、FEV1 %pre和PEF ,并能改善患者生活质量。     

ERK1/2信号通路在大鼠气道黏液高分泌中的作用研究

目的:探讨细胞外信号通路1/2(ERK1/2)在气道黏液高分泌过程中的作用。方法:通过大鼠气道内注入脂多糖(LPS)并烟熏建立气道黏液高分泌模型。分别给予ERK1/2特异性阻断剂-U01260.25mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg腹腔注射14d。提取肺组织,采用免疫组化、RT-PCR等方法检测Muc5ac、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)等的表达水平。结果:LPS及烟熏刺激可以使大鼠气道上皮Muc5ac mRNA和蛋白的表达增多,并引起p-ERK1/2与ERK1/2比值明显增高。U0126可以抑制由LPS导致的气道Muc5ac高表达和p-ERK1/2与ERK1/2比值增高。p-ERK1/2与ERK1/2的比值与Muc5ac mRNA和蛋白的表达呈正相关关系。结论:U0126可抑制LPS及烟熏所致的气道黏液高分泌状态,其机制可能是ERK1/2信号通路参与了气道黏液高分泌的调控,U0126通过特异性阻断ERK1/2从而导致黏液高分泌的下调。     

哮喘大鼠黏液分泌与Th1/Th2失衡的关系及地塞米松的调节作用

目的探讨气道黏液高分泌与Thl/Th2平衡的关系,以及地塞米松(Dex)对哮喘大鼠气道黏液高分泌及杯状细胞表达的影响。方法30只大鼠随机分为对照组、哮喘组和Dex组,每组10只。哮喘组和Dex组以卵白蛋白激发制作大鼠哮喘模型,Dex组腹腔内注入Dex作为干预因素。分别以HE、阿辛兰染色观察气道上皮的改变、杯状细胞的表达及黏液生成,ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞介素13(IL-13)和γ干扰素(IFN-γ)的浓度。结果哮喘组较对照组气道上皮杯状细胞数量明显增加(P<0.05),黏液生成增多(P<0.05),血清及BALF中IL-13表达水平显著增高(P均<0.05),IFN-γ表达水平降低(P均<0.05)。Dex组较哮喘组杯状细胞数量显著减少(P<0.05),黏液分泌减少(P<0.05),血清及BALF中IL-13表达水平明显降低(P均<0.05),IFN-γ表达水平升高(P<0.05)。结论Th2型细胞因子IL-13在哮喘大鼠气道上皮杯状细胞化生和黏液高分泌中发挥了重要作用,而Dex可以通过抑制IL-13的表达而减少气道黏液分泌。     

Murine calcium-activated chloride channel family member 3 induces asthmatic airway inflammation independently of allergen exposure

Background Expression of murine calcium-activated chloride channel family member 3 （mCLCA3） has been reported to be increased in the airway epithelium of asthmatic mice challenged with ovalbumin （OVA）. However, its role in asthmatic airway inflammation under no OVA exposure has not yet been clarified. Methods mCLCA3 plasmids were transfected into the airways of normal BALB/c mice. mCLCA3 expression and airway inflammation in mouse lung tissue were evaluated. Cell differentials and cytokines in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were analyzed. The expression of mCLCA3 protein and mucus protein mucin-5 subtype AC （MUC5AC） were analyzed by Western blotting. The mRNA levels of mCLCA3, MUC5AC and interleukin-13 （IL-13） were determined quantitatively. Results mCLCA3 expression was not detected in the control group while strong immunoreactivity was detected in the OVA and mCLCA3 plasmid groups, and was strictly localized to the airway epithelium. The numbers of inflammatory cells in lung tissue and BALF were increased in both mCLCA3 plasmid and OVA groups. The protein and mRNA levels of mCLCA3 and MUC5AC in the lung tissue were significantly increased in the mCLCA3 plasmid and OVA groups compared to the control group. The level of IL-13, but not IL-4, IL-5, IFN-y, CCL2, CCL5 or CCL11, was significantly increased compared with control group in BALF in the mCLCA3 plasmid and OVA groups. The level of IL-13 in the BALF in the mCLCA3 plasmid group was much higher than that in the OVA group （P 〈0.05）. The level of mCLCA3 mRNA in lung tissue was positively correlated with the levels of MUC5AC mRNA in lung tissue, IL-13 mRNA in lung tissue, the number of eosinophils in BALF, and the content of IL-13 protein in BALE The level of IL-13 mRNA in lung tissue was positively correlated with the number of eosinophils in BALF and the level of MUC5AC mRNA in lung tissue. Conclusion These findings suggest that increased expression of a single-gene, mCLCA3, could simulate an asthma attack, and its mechanism may involve mCLCA3 overexpression up-regulating IL-13 expression.     

Brg1通过STAT6促进哮喘气道黏液高分泌

目的研究染色质重构复合物核心催化亚基（Brg1）对哮喘小鼠气道黏液高分泌的影响及其作用机制。方法将6~8周龄 雌性野生型C57bl/6小鼠和Brg1-/-小鼠（Ⅱ型肺泡上皮细胞AEC2s上特异性条件敲低Brg1的C57bl/6小鼠）随机分为4组：正常 对照组、哮喘组、Brg1敲低对照组（Brg1-/-）和Brg1敲低后构建哮喘模型组（Brg1-/-+哮喘）,每组10只。哮喘组和Brg1-/-+哮喘组用 鸡卵清蛋白（OVA）制备过敏性哮喘模型,对照组用生理盐水代替。收取标本,用ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中 黏蛋白MUC5AC和IL-13的表达。糖原染色检测小鼠气道杯状细胞的增生和黏液分泌,q-PCR和免疫组化检测各组小鼠气道 黏蛋白MUC5AC的表达和定量。Western blot检测各组小鼠肺组织中STAT6、p-STAT6的表达。结果Brg1-/-+哮喘组较哮喘组 气道杯状细胞增生和黏液分泌均显著减少,BALF中IL-13、MUC5AC表达明显降低,肺组织MUC5AC mRNA表达显著降低, 同时肺组织STAT6和磷酸化STAT6显著下调。结论Brg1-/-敲低的小鼠建立哮喘模型时气道黏液分泌较野生型小鼠减轻,其可 能通过影响STAT6从而抑制黏蛋白MUC5AC的表达,抑制支气管哮喘气道黏液高分泌,表明Brg1具有促进哮喘气道黏液高分 泌的作用。     

CLIC-1 mRNA及蛋白在结肠癌的表达及临床意义

目的探讨氯离子通道-1(chloride intracellular channel 1,CLIC-1)mRNA及蛋白在结肠癌中的表达及其临床意义。方法采用RT-PCR和免疫组化检测2011年1-6月本院手术切除的54例结肠癌和相应癌旁组织中CLIC-1mRNA及蛋白的表达,分析其与临床病理特征的关系。结果结肠癌组织中的CLIC-1 mRNA表达水平高于癌旁组织[(0.658±0.043)vs(0.281±0.027),P<0.05],CLIC-1蛋白表达与浸润程度、有无淋巴结转移和TNM分期比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),而与患者的年龄、性别、肿瘤直径、原发部位、分化程度方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CLIC-1在结肠癌中的表达明显升高,在结肠癌的进展中可能有一定作用。     

ERS信号通路在哮喘小鼠气道黏液高分泌及气道重塑中的作用研究

目的 探讨内质网应激(ERS)信号通路在哮喘小鼠气道黏液高分泌及气道重塑中的作用.方法 选择无特定病原体(SPF)级雌性C57BL/6小鼠24只,实验分为对照组、模型组、ERS抑制剂组,每组8只.除对照组外,其余两组卵清清蛋白(OVA)+氢氧化铝制备哮喘模型,从第21天起ERS抑制剂组每次激发前30 min灌胃0.35 mg/g 4-苯基丁酸(4-PBA),对照组和模型组灌胃等体积生理盐水.对肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木精-伊红(HE)染色检测肺组织形态情况;马松染色检测肺组织胶原沉积情况;过碘酸雪夫(PAS)染色检测肺组织杯状上皮细胞增生情况;Western blot检测肺组织中肌醇需求酶1α(IRE1α)、活化转录因子6(ATF6)、ERS相关基因C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达情况.结果 相较于对照组,模型组肺血管周围聚集大量炎症细胞、肺泡间隔增厚、结构破坏、平滑肌增厚,胶原纤维沉积明显增加,杯状细胞数量明显增多;ERS抑制剂组相较于模型组炎症细胞数量减少、肺泡间隔有所增加,但结构破坏仍严重,胶原纤维沉积、杯状细胞数量均降低.与对照组比较,模型组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量,IL-6、TNF-α水平,肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78水平均升高(P<0.05);与模型组比较,ERS抑制剂组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量,IL-6、TNF-α水平,肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78水平均降低(P<0.05).结论 抑制ERS信号通路可以抑制炎性反应和气道重塑,缓解气道黏液高分泌情况,实现对哮喘小鼠的保护.