实时荧光定量PCR法检测鼻咽癌患者血浆游离EB病毒DNA的临床应用

目的 了解本地区鼻咽癌（NPC）患者血浆游离EB病毒DNA（EBV—DNA）的检出状况,探讨其诊断价值和临床意义。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术对110例鼻咽癌患者和91例其他恶性肿瘤患者（对照组）进行血浆EBV～DNA检测。结果 NPC患者EBV-DNA阳性率为56．4％（62／110）,对照组阳性率为8．8％（8／91）,经Х^2检验,Х^2=32．36,P〈0．01。男性NPC患者外周血浆EBV-DNA的阳性率为64.4％（47／73）,女性患者阳性率为40．5％（15／37）,经Х^2检验,二者差异有统计学意义（Х^2=5．67,P〈0.05）。62例血浆EBV-DNA阳性的NPC患者的拷贝数与8例血浆EBV—DNA阳性的其他恶性肿瘤患者的拷贝数比较,差异无统计学意义（经Wilcoxon非参数秩和检验,uc=1．57,P〉0．05）。结论 FQ-PCR检测血浆EBV-DNA对NPC辅助诊断有很高的临床实用价值,男性NPC患者对EBV的免疫力低于女性,更易受侵,其原因与机制有待进一步研究。     

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量，并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。     

全血中EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌患者预后中的临床意义

目的探讨鼻咽癌(NPC)患者全血中EB病毒(EBV)DNA定量检测对NPC的治疗及预后的评估价值。方法收集2015年1-12月在本院初诊的NPC患者168例(初诊NPC组),NPC放疗患者142例(NPC放疗组),NPC伴转移患者28例(NPC伴转移组),以及NPC治愈后复查患者86例,分别采集全血标本,采用实时荧光定量PCR方法检测标本中EBV DNA含量,计算各组EBV阳性率及平均拷贝数,并分析NPC患病率与EBV感染率之间的关系,比较各组间EBV DNA拷贝数对数之间的差异。结果各组EBV DNA阳性检出率分别为初诊NPC组89.3%(150/168),NPC放疗组55.0%(78/142),NPC伴转移组100.0%(28/28),前3组明显高于NPC治愈后复查组6.9%(6/86);另外,各组EBV DNA平均拷贝数分别是初诊NPC组3.52×104,NPC放疗组1.12×102,NPC伴转移组8.68×104,NPC治愈后复查组2.21×10。结论 EBV DNA检测不仅是诊断NPC的一个重要因素,而且是评估患者治疗效果,疾病进展和预后的重要因素。     

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。     

实时逆转录PCR

实时RT PCR是一种新技术 ,它利用荧光实时检测PCR反应 ,灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子灯塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器 ,即ABIPrism770 0、Lightcycler和BioradiCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT PCR策略 ,可以将实时RT PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量 ,并可通过优化设计 ,实现多重RT PCR     

实时逆转录PCR

实时RT－PCR是一种新技术,它利用荧光实时检测PCR反应,灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子打塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器,即ABI Prism 7 700、Lighteycler和Biorad iCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT－PCR策略,可以将实时RT－PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量,并可通过优化设计,实现多重RT－PCR。     

鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量与临床分期的关系研究

目的检测鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量．并分析其与鼻咽癌临床分期的关系。方法选取2012年1月至2013年1月我院肿瘤科收治住院的87例鼻咽癌患者．采用实时荧光定量PCR法检测外周血淋巴细胞EB病毒DNA含量;统计学分析其与患者临床分期的关系。结果鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA检出率为82．76％（72／87）,EB病毒DNA拷贝数的中位数为7．58×106拷贝数／ml,I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者每毫升DNA拷贝数分别为f4．25±1．141x10^3、（4．56±0．68）×10^4、（7．88±1．65）×10^5和（8．09±1．65）x106;EB病毒DNA载量随着疾病临床分期的增加呈现逐步升高的趋势。且差异显著（P〈0．05）。结论鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量与患者临床分期相关．提示EB病毒DNA载量与鼻咽癌病情进展关系密切．在临床上可作为鼻咽癌患者病情监测及判断疗效的一种有效手段。     

静脉血和鼻咽分泌物EB病毒DNA检测结果的比较

EB病毒(Epstein-Barr Virus)是由Epstein和Barr发现的一种人类疱疹病毒,常引起传染性单核细胞增多症,多年来研究表明EB病毒与低分化鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin’s病、胃癌等恶     

荧光定量PCR法检测鼻咽癌患者全血和血浆标本EB病毒DNA的比较研究

目的 研究全血和血浆标本对荧光定量PCR方法检测鼻咽癌患者EB病毒DNA的差异.方法 收集40例鼻咽癌患者的全血和血浆标本,用荧光定量PCR方法检测其EB病毒DNA含量,并对结果进行比较分析.结果 全血和血浆标本的EBV-DNA阳性率(含弱阳性)分别为85.0%和72.5%,差异无统计学意义(χ2=3.20,P>0.05),但不含弱阳性则阳性率分别为62.5%和32.5%,差异有统计学显著性意义(χ2=10.08,P<0.01);全血和血浆标本EB病毒DNA浓度几何平均浓度分别为3.58±1.42和4.72±1.53logcopies/ml,差异有统计学显著性意义(t=10.48,P<0.001);全血和血浆标本EB病毒DNA浓度有一定相关性(r2=0.787),但97.5%的患者全血载量高于血浆载量.结论 荧光定量PCR法检测EB病毒DNA全血标本好于血浆标本,更适合在临床实验室应用.     

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

实时荧光定量PCR法与基因芯片法检测HPV的比较

目的 比较基于PCR的基因芯片方法和实时荧光定量PCR方法检测女性子宫颈脱落细胞HPV DNA的相关性. 方法 收集2050份样本采用基因芯片法和实时荧光定量PCR方法进行比对试验,两者结果不符的进行测序验证,并对检测结果进行一致率及阳性率统计分析. 结果 两种方法总一致率、阳性一致率及阴性一致率都在95.0%以上;荧光定量PCR法检测HPV16阳性率50.0%,HPV18阳性率13.9%. 结论 两种方法检测的一致性良好,本实验中所使用的新型12＋2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒适合应用于育龄期妇女的宫颈癌筛查及随访.     

实时定量RT-PCR检测白血病细胞B7-H1基因表达及其临床意义

目的 检测白血病患者骨髓单个核细胞（BMMNC）B7-H1基因的表达情况，并探讨B7-H1基因表达的临床意义。方法 应用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR法（RQ-PCR）检测74例初治白血病患者及10名正常人BMMNCB7-H1mRNA表达情况，并跟踪检测12例化疗后获得完全缓解（CR）和5例复发患者B7-H1mRNA表达情况。对74例白血病患者的临床特征与B7-H1基因表达水平进行相关性分析。结果 初治白血病患者BMMNCB7-H1mRNA表达阳性，但表达水平低于正常人，两组基因定量比较值RQ为0．125。诱导化疗获得CR后B7-H1mRNA表达水平较治疗前升高，治疗前后两者定量比较值RQ为69．070，差异具有统计学意义（P=0．001）；复发时B7-H1mRNA表达水平较治疗前亦升高，复发与治疗前比较为4．00。B7-H1基因表达水平与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、骨髓中幼稚细胞比例、CD34抗原阳性与否均无相关性，与治疗反应有显著相关性。诱导化疗后未获CR的患者，其治疗前B7-H1mRNA表达水平明显高于化疗后获得CR的患者，两组定量比较值为26．91（P=0．005）。结论 初治白血病患者BMMNCB7-H1基因呈低水平表达，诱导化疗获得CR后B7-H1mRNA表达水平较治疗前升高。B7-H1基因表达水平与患者的治疗反应有显著相关性。     

荧光定量PCR在检测儿童EB病毒感染中的应用

目的探讨荧光定量PCR方法检测Epstein-Barr Virus DNA(EBV-DNA)在儿童临床EB病毒感染诊断中的价值。方法对376例表现为不明原因发热、咽炎、肝脾肿大等患儿采用实时荧光定量PCR方法检测血浆EBV-DNA。结果检测出174例患儿血浆EBV-DNA阳性,阳性率46%,其中男性100例,女性74例,年龄≤1岁36例,1岁～8岁108例,>8岁30例。结论荧光定量PCR方法检测对儿童EB病毒(EBV)感染的检测具有早期、快速等优点。     

43例多发性骨髓瘤骨髓EB病毒DNA检测

目的用荧光定量PCR方法检测急性白血病（AL）与多发性骨髓瘤患者（MN）骨髓中EBV—DNA含量,并探讨其临床意义。方法采用荧光定量PCR技术检测38例急性白血病与43倒多发性骨髓瘤患者EBV感染情况,同时检测了32例对照组小细胞低色素性贫血和巨幼细胞性贫血患者骨髓EBV—DNA含量。结果多发性骨髓瘤患者EBV感染率为58．1％,急性白血病组EBV感染率为8．0％,对照组EBV感染率6．2％。AL组与对照组EBV—DNA阳性率无显著性差异（P〉0．05）,MM组与对照EBV—DNA阳性率有显著性差异（P〈0．01）,MM组与AL组EBV—DNA阳性率有显著性差异（P〈0．01）。结论AL患者的发病与EB病毒感染关系不大,MM患者的发病与EB病毒感染有关;应用荧光定量PCR方法对MM患者骨髓中,EBV—DNA舍量进行检测,对于揭示MM的发病与EBV感染之间的相关性提供了敏感可靠的检测方法。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的数量和免疫指标,以指导临床。方法设计合成了ＨＢＶＦＱＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本。结果经ＦＱＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原、ｅ抗原、ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢＶＤＮＡ也全部阳性,平均ＨＢＶＤＮＡ拷贝数为１．１×１０８／ｍｌ;９８例ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性的标本,其阳性率为７３％（７１例）,平均拷贝数为８．６×１０５／ｍｌ,而常规ＰＣＲ只有３３％的阳性率;６７例ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性标本的平均拷贝数为２．３×１０５／ｍｌ。结论能够避免ＰＣＲ后处理导致的假阳性污染,并实现准确定量。ＦＱＰＣＲ可以检测ＨＢＶ的真实感染和复制情况,对于乙型肝炎的临床诊断,治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。     

西尼罗河病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用研究

建立特异、敏感、快速检测西尼罗河病毒(WNV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法.方法:针对西尼罗河病毒囊膜蛋白(E)的保守序列设计引物,建立WNV的实时荧光定量检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性以及稳定性.对保存的54例WNV感染者的血清样本进行检测,分析其检测的准确性.结果:建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法对WNV的检测具有高度的特异性,而对日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)等均无交叉反应,检测的灵敏度可达到100 pg.标准曲线具有较好的线性关系,相关系数为0.995,实时荧光定量PCR效率为100％.对54例WNV感染样本进行检测,准确率高达98.15％.结论:实时荧光定量PCR技术检测WNV具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可作为临床诊断WNV的手段.     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

实时定量检测乙肝患者HBV DNA及其与抗原抗体模式的关系

目的　探讨乙肝患者血清HBVDNA定量检测的临床意义及与乙肝抗原抗体模式的关系。方法　用Light CyclerTM对 315例乙肝初诊患者进行HBVDNA定量检测 ,同时定量测定乙肝表面抗原、表面抗体 ,e抗原、e抗体和核心抗体等指标 ,观察患者血清中乙肝病毒基因组含量与抗原抗体表型组合的关系。结果　在 16 9例患者血清中检测出HBVDNA ,病毒基因组拷贝值范围为 3 77× 10 2 ～ 3 12× 10 8copies ml,平均拷贝值为 3 6 7× 10 6 copies ml,阳性检出率为 5 3 6 % ;在大多数e抗原阳性的患者血清中均能检测到较高拷贝水平的病毒基因组含量 ;而在e抗原阴性患者中仍有 35 4 %可检测出HBVDNA。结论　LightCyclerTM是测定乙肝病人血清中HBVDNA含量较精确的方法之一 ,能够正确反映乙肝病毒的复制水平和活跃程度 ;乙肝特异性血清学检测结合HBVDNA定量检测分别从蛋白水平和DNA水平反映患者体内病毒的存在状态及机体的反应性 ,对临床诊断、估计病情及用药方案的选择有重要的指导意义。     

荧光定量PCR检测358例乙型肝炎病毒DNA结果分析

目的用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测血清中乙型肝炎病毒的数量以研究其临床价值.方法采用一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的实时检测定量PCR方法来检测358份临床血清标本.结果123份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本,阳性率为96.7%(120例),平均拷贝数为1.8×108/ml;108份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本其阳性率为39.8%(43例),平均拷贝数为6.6×105/ml;11份HBsAg,HBcAb阳性的标本,其阳性率为36.4%(4例),平均拷贝数为5.7×105/ml.结论FQ-PCR能够准确定量及有效避免假阳性.FQ-PCR可以真实反应HBV的感染和复制情况,对乙型肝炎的诊断,治疗方案的选择和疗效观察有较大的指导意义.