荧光定量RT-PCR检测肿瘤微转移

肿瘤微转移的定量检测不仅有助于肿瘤微转移的早期诊断、判断预后,而且为临床指导化疗提供有效的依据。本文主要论述荧光定量RT-PCR技术检测肿瘤微转移的原理、基本程序、提高定量检测准确性的一些手段及其临床意义。     

荧光定量RT-PCR检测重楼功能基因表达的差异

目的 检测重楼属植物功能基因表达的差异。方法 通过使用特异性引物和SYBR Green I 结合染料实时荧光定量RT-PCK技术,以管家基因18S rDNA为参照基因,采用相对定量的方法,对重楼属的3个种3部分组织的2个功能基因进行表达差异的研究。结果 两个功能基因包括HMGCoA还原酶基因和鲨烯环氧酶基因在根和茎均高表达于叶,尤以根的表达量最高。结论 成功将KT-PCR技术应用于药用植物的功能基因研究。通过对各种条件的优化探索,建立了准确和简单易行的检测药用植物的功能基因表达的平台。     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒(DV)及DV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系.检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达1×103 copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为O.792.结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DV RNA载量.     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与传统的血凝抑制法进行比较。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法只有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

用荧光半定量RT-PCR检测蚊溴氰菊酯抗性

目的:建立蚊对菊酯类杀虫剂抗性的PCR检测方法。方法:应用荧光半定量RT鄄PCR,检测经SSH结合cDNA芯片分离鉴定的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关基因NYD鄄Tr在抗性品系与敏感品系中的表达水平。结果:经荧光半定量RT鄄PCR检测,NYD鄄Tr进入指数期的循环数抗性品系早于敏感品系,抗性品系组比敏感品系组先进入指数增长期。结论:以NYD鄄Tr作为靶基因,荧光半定量RT鄄PCR可区分淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系与敏感品系,亦即可检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。     

I型鸭肝炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立快速诊断I型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法 根据NCBI下载的20个来自我国不同省份的的I型鸭肝炎病毒的基因序列,找出其保守序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果 该方法敏感性达20拷贝,比常规PCR敏感性高。其特异性强,对番鸭细小病毒(MDPV),鹅细小病毒(GPV),新城疫病毒(NDV)和禽流感(AIV),鸭减蛋综合征病毒(EDSV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),禽呼肠弧病毒(ARV)8种病毒的检测均为阴性,I型鸭肝炎病毒检测结果为阳性。用建立的方法检测了江苏徐州采集100份样品,阳性率为92%。说明I型鸭肝炎病毒在江苏徐州地区的鸭群中普遍存在。结论 建立了I型鸭肝炎病毒荧光定量PCR方法。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法，用于小鼠诺如病毒（Murine Norovirus，MNV）的检测。方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针，同时设计和制备了内标用于监控假阴性，建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系，通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线；进行特异性、敏感性和重复性试验，最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本，验证在临床应用中的效果。结果 该方法特异性强，与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数R2＝0.9986，可以检测到10拷贝/μL的质粒标准品，对MNV活病毒检测可检测到1.78?0-2 TCID50/mL的病毒，检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍，比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测，检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测，检测到阳性样品103份，阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。 结论 本研究建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，由于加入了内标, 能有效地监控假阴性的出现，适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

实时荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌骨转移相关基因表达的研究

目的研究CXCR4、CTGF、MMP-1、IL-11、MST1R、ETV-1 6种基因在鼻咽癌细胞5-8F与骨共培养前后的表达情况,分析这些基因在鼻咽癌骨转移中的作用。方法采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RT-PCR检测5-8F细胞与骨共培养前后骨转移相关基因的表达情况。结果5-8F细胞与骨共培养后CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1的表达水平较共培养前差异有显著性(P<0.05),均表达上调;MMP-1、IL-11则差异无显著性。结论实时荧光定量RT-PCR能够敏感、特异地检测出鼻咽癌细胞在与骨组织共培养前后的mRNA的表达变化,方法准确可靠,操作方便;CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的潜在标志物。     

实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中的应用价值

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中的应用价值。方法选取2015年10月至2017年3月淮阳县疾病预防控制中心收治的280例疑似麻疹患者,所有患者均接受酶联免疫吸附试验(ELISA)与实时荧光定量RTPCR检测,对比两种检测方法的阳性率。结果 280例疑似麻疹患者中,经实时荧光定量RT-PCR检测咽拭子中麻疹病毒核酸阳性的有166例,阳性率为59.29%;ELISA法检测出血清麻疹Ig M阳性的有139例,阳性率为49.64%。实时荧光定量RT-PCR检测阳性率较ELISA法高,差异有统计学意义(P<0.05)。出疹当天标本的实时荧光定量RT-PCR阳性率为56.52%,ELISA法检测阳性率为17.39%。随着时间的推移,ELISA法检测阳性率不断上升,而实时荧光定量RT-PCR检测在第4天开始逐渐下降。实时荧光定量RT-PCR对出疹2 d内标本检测阳性率较ELISA法高,差异有统计学意义(P<0.05);对于出疹后2 d及2 d以上的标本,两种检测方法阳性率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中具有较高应用价值,可早期诊断麻疹病毒,是一种安全、可靠的检测方式。     

应用荧光定量RT-PCR法检测牡蛎中诺如病毒

目的建立牡蛎样品中的诺如病毒检测方法。方法优化甘氨酸缓冲液处理牡蛎匀浆液,摸索PEG沉淀浓缩病毒的浓度,提取病毒RNA,采用荧光定量RT-PCR方法进行诺如病毒检测。应用优化后的方法检测105份牡蛎样本,并用核苷酸序列测定法对阳性PCR产物进行验证。结果甘氨酸缓冲液pH值为4.5,PEG沉淀浓度为16%时的诺如病毒富集提取效果最好,该方法的诺如病毒检出限为1.17×102个质粒拷贝。应用该方法对未知样本进行检测阳性率达14.29%,所得阳性PCR产物经核苷酸序列测序证实为诺如病毒。结论本研究方法可以应用于牡蛎中的诺如病毒检测,南宁市海鲜市场上的部分牡蛎含有诺如病毒。     

犬SLAM受体mRNA荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

目的建立荧光定量PCR方法,检测犬不同组织中SLAM受体mRNA的表达水平。方法以犬GAPDH为内参基因采用△△Ct法,分析SLAM受体mRNA在犬体内不同组织中的表达。结果此方法有较高的重复性,变异系数在0.89%～2.35%。以SLAM受体在心脏的表达为1倍值,结果显示受体mRNA在脾脏中表达最高,为38.49倍;肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结中表达次之,分别为9.13、8.58、6.24倍;膀胱中表达最低。结论成功建立了检测SLAM受体mRNA在不同组织中表达水平的荧光定量PCR检测方法。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性探讨

目的:探讨HBV-DNA的检出情况与乙肝两对半结果之间的关系。方法:运用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测307例疑似乙肝患者血清中的HBV-DNA,同时运用ELISA方法进行两对半指标的检测,并对结果进行相关性探讨。结果:HBsAg( )HBeAg( )HBcAb( )组(大三阳组)患者血清HBV-DNA检出率为98.15%(53/54),平均拷贝数为7.56E 06/m l;HBsAg( )HBeAb( )HBcAb( )组(小三阳组)患者血清HBV-DNA检出率为27.78%(15/54),平均拷贝数为3.79E 05/m l;HBsAg( )HBcAb( )组血清HBV-DNA检出率为91.18%(31/34),平均拷贝数为2.85E 05/m l,小三阳组HBV-DNA阳性检出率及拷贝数均低于大三阳组,且与大三阳组比较均具有显著性差异(P<0.01,P<0.05);HBsAb( )组血清HBV-DNA检出率为1.6%(1/63),平均拷贝数为1.13E 08/m l;HBcAb( )组血清HBV-DNA检出率为16.67%(1/6),平均拷贝数为3.00E 04/m l;HBsAb( )HBeAb( )HBcAb( )组血清HBV-DNA检出率为12.50%(4/32),平均拷贝数为3.00E 05/m l;HBsAg( )组血清HBV-DNA检出率为0(0/2);HBV-M全阴性组HBV-DNA检出率为1.61%(1/62),平均拷贝数为2.75E 05/m l。结论:HBV-M阴性患者仍有HBV-DNA阳性者,因此在检测中应联合应用两种方法进行检测,提高检出率,避免漏诊,为临床HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗提供更为可靠的判定依据。     

荧光定量PCR技术检测生殖道人乳头瘤病毒6,11型结果分析

目的:了解人乳头瘤病毒6,11型(HPV6,11)的检出情况。方法:采用荧光定量PCR法对125例患者进行HPV6,11 DNA定量检测。结果:HPV6,11阳性率为32.00%(44/125);男性和女性阳性率分别为62.50%和6.56%;21～40岁年龄段患者占90.91%;2009年、2010年和2011年阳性检出率分别为55.56%、40.00%和27.78%,有下降趋势。结论:加强患者人乳头瘤病毒6,11型的检测,对其防治有重要意义。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

树鼩IL-2TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立检测树鼩IL-2基因TaqMan探针实时荧光定量PCR方法.方法 以经ConA诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆出树鼩IL-2基因,以构建的树鼩IL-2基因质粒为标准品,建立标准曲线,并进行灵敏度检测.结果 建立了树鼩IL-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,此法检测灵敏度高,线性范围可达102～109拷贝/ul.结论 成功建立了树鼩IL-2实时荧光定量PCR方法,此方法灵敏度高、特异性强,检测周期短,为探讨IL-2作用的分子作用机制奠定基础.     

HCV及HIV二联病毒核酸荧光PCR检测方法的建立

目的建立多联病毒核酸荧光PCR检测方法,为我国核酸检测技术的应用前景提供技术支持。方法使用逆转录实时荧光PCR定量方法（QRT。PCR）检测HCV、HIV病毒,在成功扩增定量单一病毒的基础上,通过主要调整Mg2＋离子、dNTPs、Taq的浓度等优化反应体系,建立同时检测两种病毒核酸的逆转录实时荧光PCR定量检测方法（一步法双检）,并分析双检体系的扩增灵敏度。结果通过优化筛选反应条件,使用QRT．PCR方法成功扩增双模板HCV／HIVRNA,且检测特异性好,灵敏度较高,能达到HCVRNA20IU／ml与HIVRNA80IU／ml的检测灵敏度。结论本试验成功建立能同时检测两种病毒核酸的QRT．PCR方法,为后续研究HBV、HCV、HIV多联荧光病毒核酸检测系统提供了理论依据与技术支持。     

Fluorescent antibiotics for real-time tracking of pathogenic bacteria

The harm of pathogenic bacteria to humans has promoted extensive research on physiological processes of pathogens, such as the mechanism of bacterial infection, antibiotic mode of action, and bacterial antimicrobial resistance. Most of these processes can be better investigated by timely tracking of fluorophore-derived antibiotics in living cells. In this paper, we will review the recent development of fluorescent antibiotics featuring the conjugation with various fluorophores, and focus on their applications in fluorescent imaging and real-time detection for various physiological processes of bacteria in vivo.     

实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒

目的探讨实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA载量与抗-HCV及丙氨酸氨基转移酶（ALT）异常的相关性。方法用FQ—PCR检测115份疑似HCV感染的病人血清HCV—RNA，ELISA法检测抗-HCV，全自动生化分析仪测定ALT。结果以80拷贝／ml血清为标准，115份标本中HCV—RNA阳性率为54．8％（63／115）；抗-HCV阳性率为53．9％（62／115）；ALT异常率为40．9％（47/115）。HCV—RNA载量与抗-HCV（＋）例数呈正相关（r=0．986，P〈0．01）。HCV—RNA载量与ALT异常例数（r=0．94，P〈0．01）、含量（r=0．624，P〈0．01）呈正相关。结论HCV—RNA载量升高，抗-HCV阳性率相应增加，ALT高于正常值（40U／L）的异常率和浓度也增高，均呈正相关。FQ—PCR法可作为临床检测丙型肝炎的确诊方法之一。